オルガノイド培養を用いた難治性乳がんにおける休眠スイッチと悪性化分子機構の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07635
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 中山 哲俊 千葉大学, 大学院医学研究院, 特任助教 (10835226)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 知明 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (50447299) ; 山形 一行 千葉大学, 大学院医学研究院, 助教 (60455912) ; 永野 秀和 千葉大学, 大学院医学研究院, 特任講師 (60788876)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 乳癌 / p53 / 癌抑制遺伝子 / 3次元培養 / 休眠

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、変異p53のもたらす"gain of function"がcancer initiatingやメバロン酸合成経路を介し、どの様にがんの増悪に関与しているのか、その作用機序を通して乳がんにおける悪性化分子機構と休眠スイッチ機構の解明を目的としている。これまでの研究において、CRISPR/Cas9により作成したMDA-MB-231 p53KO細胞株にp53WTと元々の形質である変異p53(R280K)をDoxycycline依存的に発現する細胞株をTet-On Systemを用い作成している。それらを用いp53を発現させ3次元培養を行い、同じ細胞種でのp53の違いによるがん悪性化形態の差を確認し、p53(R280K)のgain of functionががんの悪性化に重要であることを確認していた。今年度はそれらの細胞株を用い、培養条件の違いでの悪性形質の変化をまず確認したところ、コレステロール量の違いにより悪性形質が変化することを見出した。その一方で、変異p53の悪性化に関しても、変異p53による悪性化に関与する可能性のある因子を同定し、現在解析を進めている。また、2次元培養・3次元培養でのSingle cell RNA-seqを行い、培養条件や細胞株ごとの遺伝子発現の違いを確認した。その結果、単一の細胞株であるはずのMCF7やMDA-MB-231でもヘテロジェナイティがあることが明らかとなり、現在それぞれの条件を比較して解析を行っている。今後は、p53の違いだけでなく、悪性形質が現れるコレステロール条件下でRNA-seqやノンターゲットプロテオミクスを行い、悪性形質をもたらす遺伝子候補群を同定する予定である。そこで見出された候補遺伝子群が悪性形質や休眠に関与しているか検討し、悪性化と休眠スイッチ機構の解明につなげる予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

主にMDA-MB-231を用いた解析を重点的に進め、変異p53による悪性化に関与する遺伝子候補を見出した。また、コレステロール状態の違いで悪性形質が変化することを見出し、そこからメバロン酸合成経路の中でも特にGGPP経路が悪性形質に関与していることを確認した。また、Single Cell RNA-seqを行い単一細胞レベルでの解析を進めている。

Strategy for Future Research Activity

今後は、Single Cell RNA-seqの解析を進めると共に、p53ステータスの違いだけでなくコレステロール状態の違いによるRNA-seq及びノンターゲットプロテオミクス解析を行う。また、ChIP-seqも行い、それらから悪性形質をもたらす遺伝子候補群を同定する。更に、その見出された候補遺伝子、並びに今回同定した変異p53による悪性化に関与する遺伝子に関して、ノックダウンやノックアウトを行い、実際に悪性形質や休眠に関与しているのか検討する。また同時に、in vivo、臨床検体での検討を進める予定である。

Research Products

• [Journal Article] TAS4464, a NEDD8-activating enzyme inhibitor, activates both intrinsic and extrinsic apoptotic pathways via c-Myc-mediated regulation in acute myeloid leukemia. (2021)
  • Author(s): Ochiiwa H, Ailiken G, Yokoyama M, Yamagata K, Nagano H, Yoshimura C, Muraoka H, Ishida K, Haruma T, Nakayama A, Hashimoto N, Murata K, Nishimura M, Kawashima, Y, Ohara O, Okubo S, Tanaka T
  • Journal Title: Oncogene Volume: 40 Pages: 1217-1230
  • DOI: 10.1038/s41388-020-01586-4
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Monoamine oxidase B rs1799836 G allele polymorphism is a risk factor for early development of levodopa-induced dyskinesia in Parkinson's disease. (2020)
  • Author(s): Kakinuma S, Beppu M, Sawai S, Nakayama A, Hirano S, Yamanaka Y, Yamamoto T, Masafumi C, Aisihaer X, Aersilan A, Gao Y, Sato K, Sakae I, Ishige T, Nishimura M, Matsushita K, Satoh M, Nomura F, Kuwabara S, Tanaka T.
  • Journal Title: eNeurologicalSci. Volume: 19 Pages: 100239
  • DOI: 10.1016/j.ensci.2020.100239
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A case of Hashimoto’s thyroiditis with multiple drug resistance and high expression of efflux transporters. (2020)
  • Author(s): Yoshida T, Nakayama A, Tamura A, Higuchi S, Sakuma I, Nagano H, Saulo J.A. Felizola, Takemoto M, Tatsuno I, Koide H, Yokote ,K, Tanaka T.
  • Journal Title: J Clin Endocrinol Metab. Volume: 105 Pages: 399-406
  • DOI: 10.1210/clinem/dgz073
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Mechanism of Mutant p53 Using Three-dimensional Culture on Breast Cancer Malignant Phenotype via SREBP-dependent Cholesterol Synthesis Pathway (2021)
  • Author(s): Akitoshi Nakayama, Masataka Yokoyama, Hidekazu Nagano, Naoko Hashimoto, Kazuyuki Yamagata, Kazutaka Murata, Tomoaki Tanaka
  • Organizer: Endocrine Society’s Annual Meeting 2021
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 3次元培養を用いた乳がん悪性化形質に対する変異p53・SREBP依存的コレステロール合成経路の協調的作用機構 (2020)
  • Author(s): 中山 哲俊, 横山 真隆, 永野 秀和, 山形 一行, 橋本 直子, 村田 和貴, 田中 知明
  • Organizer: 第79回日本癌学会総会
• [Presentation] マルチオミクス解析から捉える下垂体腺腫の特徴 (2020)
  • Author(s): 高 躍, 永野 秀和, 堀口 健太郎, 橋本 直子, 中山 哲俊, 樋口 誠一郎, 山形 一行, 横山 真隆, 岩立 康男, 田中 知明
  • Organizer: 第93回日本内分泌学会学術総会
• [Presentation] コルチゾール産生腺腫における新規PRKACA変異同定と機能解析 (2020)
  • Author(s): 樋口 誠一郎, 高 躍, 姚 躍, 大和 梓, 橋本 直子, 永野 秀和, 中山 哲俊, 西村 基, 山形 一行, 横山 真隆, 藤井 陽一, 小川 誠司, 田中 知明
  • Organizer: 第93回日本内分泌学会学術総会
• [Presentation] 癌抑制遺伝子p53シグナル伝達におけるmiR-874の役割(Role of miR-874 on tumor suppressor gene p53 signaling) (2020)
  • Author(s): Alimasi Aersilan, 橋本 直子, 山形 一行, 姚 躍, 高 躍, 中山 哲俊, 関 直彦, 田中 知明
  • Organizer: 第93回日本内分泌学会学術総会
• [Presentation] APA74例の臨床解析/ゲノムワイド解析による病態解析と病理学的解析 (2020)
  • Author(s): 宮林 佑衣, 横山 真隆, 山形 一行, 橋本 直子, 中山 哲俊, 姚 躍, 永野 秀和, 田中 知明
  • Organizer: 第93回日本内分泌学会学術総会
• [Presentation] 3次元培養を用いた乳がんにおける変異p53とSREBP依存的コレステロール合成経路の悪性化形質に対する協調的作用機構 (2020)
  • Author(s): 中山 哲俊, 横山 真隆, 永野 秀和, 樋口 誠一郎, 橋本 直子, 山形 一行, 佐久間 一基, 清野 透, 田中 知明
  • Organizer: 第93回日本内分泌学会学術総会