2020 Fiscal Year Research-status Report
p53 pathway and its potential targeted therapeutic approach
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19K07645
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
時野 隆至 札幌医科大学, 医学部, 教授 (40202197)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | p53 / がん抑制遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
p53はヒト悪性腫瘍で最も高頻度に変異している遺伝子であるが，「がん抑制遺伝子」であるためp53経路をターゲットとした抗がん剤の開発は遅れている．そのためp53転写ネットワークの全貌を解明することは，がんゲノム情報にもとづいたがん治療に有望な分子標的治療薬の開発につながる可能性がある．
本年度の研究目的は，ヒトの癌においてp53活性化とXPO1発現抑制を機能的に関連付けることである．背景としてExportin 1（XPO1）は，核外輸送シグナル依存性の核外輸送に関与する．いくつかの種類の腫瘍で過剰発現し，腫瘍抑制タンパク質を含む核因子の細胞内局在異常をもたらす．p53腫瘍抑制遺伝子はmicroRNAを介してXPO1の転写抑制をしていることを発見した．外因性XPO1発現はmiR-142-3pによるp53の核移行を阻害した．XPO1は変異型p53遺伝子を含む原発性乳がん組織で過剰発現していた．また，XPO1の高発現は，乳がんおよび結腸がん患者の予後不良因子として役立つ可能性があることも見いだした．本年度の結論として，p53タンパクの細胞内局在がmicroRNAによって調節されるというこれまで明かにされていなかったメカニズムを明らかにした．p53，miR-142-3p，およびXPO1が正のフィードバックループを形成しているを明らかにした．すなわち，p53はmicroRNAであるmiR-142-3pを介して，核外輸送タンパク質XPO1の発現を負に調節していることを発見した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ノーザンブロット，イムノブロット，およびルシフェラーゼアッセイを利用してXPO1転写におけるp53の影響を調査した．p53タンパクの細胞内局在は，細胞分画後の蛍光顕微鏡およびイムノブロットによって解析した． Oncomine utilityを利用して，XPO1発現と腫瘍組織のp53変異状態との関係を検証することに成功した．野生型p53が導入したとき，内因性XPO1発現はいくつかの腫瘍細胞で減少した．ヒトおよびげっ歯類の細胞において，DNA損傷によってp53依存的にXPO1の発現が減少されることがわかった．miRNAマイクロアレイとin silico miRNAターゲット予測を組み合わせることで，p53はmiR-142-3pの発現を誘導し，XPO1の3'-UTR内のmiR-142-3p結合部位を介してXPO1の発現レベルを低下させた． miR-142-3pはXPO1レベルを低下させ，さらにp53の核内滞留と細胞周期停止を引き起こした．miR-142-3p特異的阻害剤はp53の核移行を妨げた．重要なことに，外因性XPO1はmiR-142-3pによるp53の核移行を阻害した．興味深いことに，XPO1は変異型p53遺伝子を含む原発性乳がん組織で過剰発現していた．また，XPO1の高発現は，乳がんおよび結腸がん患者の予後不良因子として役立つ可能性があることも見いだした．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の推進方策として，p53により転写制御されがん浸潤・転移に関与する標的microRNAおよび長鎖非コードRNA (lncRNA) を探索・同定し，そのp53転写標的非コードRNA遺伝子の機能を解明する．このようながん浸潤・転移に関与する非コードRNA遺伝子の同定は，がんの予後予測および分子標的治療薬の開発に発展できる可能性がある．
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| Causes of Carryover |
近年，複数の腫瘍細胞株および臨床症例においてRNA-seqおよびChIP-seq等の解析結果データが公開され，利用可能となった．そのため次世代シーケンサーを利用したRNA-seqおよびChIP-seq解析実験に関わる高価な試薬の節約ができた．次年度の使用計画として，p53の直接の転写標的となるmiRNAおよびlncRNAを同定し，それらの非コードRNAが発現制御する遺伝子群の同定とその機能解析を行うために，本年度の未使用額をその経費に充てることとしたい．
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