2019 Fiscal Year Research-status Report
Regulation mechanism of apoptosis-inducing death receptor localization allowing for survival in tumor cells
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19K07648
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
小島 裕子 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60231312)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | DR5 localization / TRAIL / TRAIL-resistant tumor / Importin β1 inhibition / Agonistic antibody / Cancer therapy |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究に関連してTRAIL/DR5耐性ヒト腫瘍細胞株のマウス異種移植モデルを作成、３種の方法でimportin β1を阻害し、in vivoで腫瘍の拒絶を誘導できることを証明した。
1. Doxycycline誘導性にimportin β1の発現をノックダウンする、２種類のHeLa細胞株：#B1、#C14およびコントロール細胞株を作成、RAG-2(-/-)マウスの皮下生着後、 Doxycycline飲水投与と非投与群に分け、各群で抗DR5アゴニスティック抗体：CS-1008またはコントロール抗体：hIgGを腹腔内投与、４群の腫瘍増殖を比較。その結果、Doxycycline投与且つCS-1008投与群で、有意に腫瘍の増殖が抑制、うち#C14腫瘍は完全に拒絶された。
2. RAG-2(-/-)にHeLa細胞株またはHepG2細胞株の皮下生着後、実験１で用いた２種類のimportin β1 ノックダウン配列B、Cおよびコントロール配列を移入したベクタープラスミドDNAを、アテロコラーゲンと共に腫瘍周囲に接種し徐放性にノックダウンを誘導、Doxycycline飲水投与とCS-1008またはhIgGを腹腔内投与し、各群で腫瘍の増殖を比較。その結果、in vivoでimportin β1ノックダウンを誘導した群で、HeLaで腫瘍の増殖抑制が、HepG2で拒絶された。
3. RAG-2(-/-)にHeLaまたはHepG2を皮下生着後、CS-1008またはhIgGとimportin β阻害剤：importazoleまたは溶媒接種を開始。各群で腫瘍の増殖を比較。その結果、HeLaで増殖抑制が、HepG2で拒絶された。
何れの実験でもin vitroでDR5の細胞膜発現が増加しアポトーシスが誘導されることから、TRAIL/DR5耐性ヒト腫瘍の治療にDR5局在コントロールが寄与する可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
投稿準備中の論文を作成して投稿した後、レビューアーに要求されたリバイスの実験を行い、その実験結果を加えて論文修正を行い、論文受理までに時間を要したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
I. タンパク質合成後の核内DR5の運搬ルートの解析
① 細胞表面でTRAILと結合したDR5の動態解析：蛍光標識したリコンビナントTRAILを，DDを欠損した野生型 (WT) DR5-GFP発現腫瘍細胞と，2種のNLS変異型 (NLS-M1, -M2) で且つDD欠損のDR5-GFP発現腫瘍細胞に作用させてレーザー顕微鏡で解析，膜でTRAILと結合したDR5が核内に移行しないかを確認する．② 小胞体 (ER) からゴルジ装置 (Golgi) へのDR5輸送とその局在解析：①の細胞にBrefeldin Aを作用させて，ERからGolgiへのタンパク質輸送を阻害した時のDR5-GFPの局在を解析し，未処理の細胞と比較して変化するかを検討する．
II. hDR5の局在の決定に関与する分子の探索・その分子の発現と機能の相関の解析
① hDR5の局在決定に関与する分子の探索：バーコード化されたヒトshRNAライブラリーを用いてTRAIL抵抗性ヒト腫瘍細胞株に組換えウイルスを感染させ，同時に組み込まれた蛍光タンパク質を指標にして，核内への運搬が抑制されて細胞表面でDR5の発現が増加している細胞集団を集め，それを純化する．バーコードによる次世代ハイスループットシーケンシングを行って解析し，ノックダウンにより細胞表面のDR5の発現が高くなるshRNA標的分子を複数ピックアップする． DR5の発現量を変化させずに，腫瘍細胞のTRAIL感受性を有意に上昇させることが可能な，DR5の局在の決定に働く候補分子を同定する．② 腫瘍細胞における候補分子の発現と機能との相関性の解析：様々なTRAIL感受性及び低感受性腫瘍細胞株において，候補分子の発現量とDR5の局在を調べ，DR5の核内移行との相関を明らかにする．
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| Causes of Carryover |
学会出張費を本研究旅費より支払わなかったことによる。次年度の物品費として使用予定である。
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Research Products
(2 results)
