Regulation mechanism of apoptosis-inducing death receptor localization allowing for survival in tumor cells

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07648
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 小島 裕子 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (60231312)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 腫瘍細胞 / 細胞死 / DR5 / TRAIL / 局在 / 細胞内輸送 / タンパク質発現調節

Outline of Annual Research Achievements

細胞内で合成されたDR5タンパク質が、細胞膜に発現後、細胞内に取り込まれて核に運ばれるのか、合成後に細胞膜を経ずに核内に運ばれるのかを明らかにする目的で、Importin β1と結合する２箇所の核移行シグナル(NLS)をそれぞれ変異させた、GFP-DR5を発現する２種類の変異型HeLa細胞株(MT)と野生型GFP-DR5を発現するHeLa細胞株(WT)を用いて、Brefeldin A（BFA）の効果をフローサイトメトリー (FACS)で比較検討した。その結果、全ての細胞株で細胞全体に発現するDR5の量には変化がなく、細胞膜の発現のみがBFAによって抑制された。また、BFAとER Trackerを用いたレーザー顕微鏡によるGFP-DR5の局在解析では、WTはBFAの添加に関わらず核内DR5を大量に発現していたのに対して、MTは細胞膜の他に細胞内に集積し、その一部はERと重なった。以上より、DR5は細胞膜を経由せずに核内に運ばれると考えられた。
次に、合成されたDR5の輸送先を、核か細胞膜かに仕分ける機能を持つ分子を探索する目的で、バーコード化された約6,500種類のヒトタンパク質に対する約55,000種類のshRNAを含む、ヒトゲノムワイドshRNAライブラリーをHEK293T細胞株に移入し、偽レンチウイルス粒子を調製、濃縮した。それを、１個の細胞に対して複数のshRNAを持つウイルスが感染しないような条件で、HeLa細胞株に感染させて遺伝子導入した。shRNAと同時に導入された薬剤耐性遺伝子発現細胞を、ピューロマイシン添加により選択して増殖後、抗DR5抗体で蛍光標識し、shRNAと同時に遺伝子導入されたTag RFPを発現する細胞の中から、親株のHeLa細胞よりも細胞膜のDR5発現が高い細胞集団をFACSでソートした。採集した細胞を増殖後、再び同様のソートを行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

初年度の遅れに加え、４月から５月にかけての緊急事態宣言中に一時実験を止めたこともあり、遅れが完全に取り戻せていない状況ではあるが、目的の実験遂行に向けて鋭意努力中である。

Strategy for Future Research Activity

今年度作製した、バーコード化ヒトゲノムワイドshRNAライブラリーモジュール#2（標的遺伝子：疾患関連遺伝子、薬剤標的遺伝子）を遺伝子導入した腫瘍細胞集団について、FACSによるTag RFP陽性且つDR5強陽性細胞のソートを繰り返し行い、親株のHeLa細胞株に比べて、有意に細胞膜にDR5を高発現する細胞集団が純化する。それを増殖させて各shRNAに１対１で対応するバーコード付きDNAを抽出する。次世代シーケンシング受託解析サービスを利用して、得られたDNA中のshRNAの種類と割合について、分析結果を得る。その結果を元に、各々の遺伝子を単独、または組み合わせて腫瘍細胞に遺伝子導入し、細胞全体のDR5発現量は変化させずに、細胞膜の発現量が増加する標的タンパク質を絞り込む。更に、細胞膜でのDR5発現が増加した結果、親株の腫瘍細胞に比べて、特定のタンパク質をノックダウンした細胞の方で、TRAILによる細胞死誘導が亢進することを確認する。
仮に、FACSによるソートを繰り返しても目的の細胞集団が得られない場合は、ヒトゲノムワイドshRNAライブラリーのモジュール#1（標的遺伝子：シグナル伝達関連遺伝子）またはモジュール#3（標的遺伝子：細胞表面マーカー遺伝子、細胞外基質遺伝子、DNA結合遺伝子）を用いて、今年度と同様にHeLa細胞株へのshRNAライブラリーの遺伝子導入を行う。それによって条件を満たす細胞集団が得られたら、次世代シーケンシング受託解析サービスを依頼し、その結果を元に上記の実験を行う。これらの結果より、腫瘍細胞内で、細胞膜と核へのタンパク質輸送調節に関与する候補分子を絞り込む。

Causes of Carryover

学会に参加しなかったため、参加費及び旅費の余剰金が生じたが、試薬や器具等の消耗品が不足していたため、その購入に充てた。年度末時点で購入希望試薬は存在したが、購入するには不足だったため、次年度予算に回した結果、少額ながら残金が発生した。