EZH2過剰発現により誘導される新規異常複合体の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07661
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 新城 恵子 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (40641618)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: EZH2 / 複合体

Outline of Annual Research Achievements

EZH2過剰発現により、がんは悪性度の高い性質を持つことが多いが、その機序は明確ではない。一方で、EZH2はがんにおいて異常な複合体を形成することが報告されている。我々はEZH2過剰発現している腫瘍細胞において、EZH2はこれまでに複合体を作ることが報告されていないタンパク質（ヒストンメチル化酵素X）と複合体を形成していることを見出し、この機能を明らかにすることを目的として研究を行っている。
この新規EZH2複合体は通常の複合体とは別の新たな機能を獲得している可能性があるため、この複合体に含まれるタンパクを同定するために免疫沈降を複数のがん細胞株で行なった。ヒストンメチル化酵素Xで免疫沈降を行うと、EZH2のみではなく、SUZ12も結合していることが明らかになった。また、この新規複合体は複数のがん細胞株で存在することも明らかとなった。さらに細胞株を追加して検討を行い、どのような細胞でこの新規複合体が存在するかを、各種がん細胞、正常細胞において検討する。EZH2の発現量と細胞の遺伝子変異などの情報を合わせて検討し、新規複合体ができる条件を明らかとする。
新規複合体にのみ含まれるタンパクを質量分析で同定するため、それぞれのタンパク質にタグタンパク質をつけたベクターを作成している。このベクターを使用してクロマチン免疫沈降も予定しており、それぞれのタグタンパクによるChIPを行うことで、新規複合体が修飾するゲノム領域を同定する。FRETシステムを用いたスクリーニング系の構築のため、それぞれのタンパク質に蛍光タンパク質をつけたベクターも現在作成中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

複数のがん細胞株を用いてヒストンメチル化タンパクXで免疫沈降し、ウエスタンブロットで通常のPRC2に含まれているSuz12、EEDなどのタンパク質が存在するかを確認し、この新規複合体の存在を確認した。また、SUZ12は存在することが確認できが、EEDは含まれていないようであった。
ゲノム上の修飾領域を検索するため、同じベクター上にヒストンメチル化タンパクX－タグタンパクーEZH2－タグタンパクをのせ、同時に強制発現できる系を作成している。また、それぞれのタンパク質に蛍光タンパク質をつけたベクターも現在作成中で、完成したらFRETを用いて複合体の存在や、形成する条件などを確認することが可能である。

Strategy for Future Research Activity

ヒストンメチル化タンパクX－タグタンパクーEZH2－タグタンパクを同一ベクターで発現可能となったら、このシステムを用いて免疫沈降を行い、新規複合体内に含まれるタンパク質を同定する。PRC2複合体を形成しているのか、全く異なるタンパクが含まれるのかを確認する。また、この系を用いChIP-seqを行う。ゲノム上のどのような領域を修飾しているのか、その部位は活性化修飾されるのか、抑制化修飾されるのかを詳細に検討し、この新規複合体の果たす役割を検討する。
FRETシステムを構築し、複合体の形成される条件を同定する。さらに複合体形成を阻害する小分子化合物のスクリーニング系が可能となるように準備を進める。

Causes of Carryover

調達方法の工夫により経費節約ができたため、次年度に使用することとした。次年度にはDUOLINK試薬の購入に充てることを予定している。

Research Products

• [Journal Article] Pathogenic Epigenetic Consequences of Genetic Alterations in IDH-Wild-Type Diffuse Astrocytic Gliomas. (2019)
  • Author(s): Ohka F, Shinjo K, Deguchi S, Matsui Y, Okuno Y, Katsushima K, Suzuki M, Kato A, Ogiso N, Yamamichi A, Aoki K, Suzuki H, Sato S, Arul Rayan N, Prabhakar S, Goke J, Shimamura T, Maruyama R, Takahashi S, Suzumura A, Kimura H, Wakabayashi T, Zong H, Natsume A, Kondo Y
  • Journal Title: Cancer Research Volume: 79 Pages: 4814-4827
  • DOI: 10.1158/0008-5472
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research