2020 Fiscal Year Research-status Report
腫瘍細胞とキメラ抗原受容体Ｔ細胞のエネルギー代謝の相違に着目した次世代細胞治療
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19K07751
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
三輪 啓志 三重大学, 医学系研究科, 産学官連携講座准教授 (00209967)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | CAR-T細胞 / エネルギー代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度に引き続き、細胞内シグナルドメインが異なるCD19 CAR-T細胞（αβ、γδ）のエネルギー代謝様式を検討した。①抗原刺激により培養液中のグルコースの消費、乳酸の産生ならびにグルタミンの消費、アンモニアの産生を経時的に測定。②蛍光標識グルコースあるいは蛍光標識脂肪酸の取り込みをフローサイトメーターにて測定。③抗原刺激時に解糖阻害薬、脂肪酸酸化阻害薬、グルタミン代謝阻害薬あるいはミトコンドリアでの酸化的リン酸化阻害薬を添加することによるγ-インターフェロン産生への影響を検討。④解糖阻害薬、脂肪酸酸化阻害薬あるいはグルタミン代謝阻害薬等を添加培養後に標的細胞であるNALM-6細胞と共培養し細胞傷害活性を見る。（細胞傷害活性に重要なエネルギー代謝経路の推定）⑤seahorse flux analyzerにより酸素消費速度（OCR）、細胞外酸性化速度（ECAR）を測定することにより抗原刺激時に優位に用いられる代謝経路を解析する。この測定で産出される予備呼吸能（SRC）はCAR-T細胞療法においてより有効と考えられるメモリーフェノタイプとの関連が示唆されている。また、細胞のATP産生に際し、解糖、ミトコンドリアでの酸化的リン酸化の寄与度も検討をおこなっている。⑥ミトコンドリア膜電位を測定するTMRMで染色し膜電位とメモリーフェノタイプとの関連を見る。上記の検討により、各細胞内ドメイン（28z、4-1BBzなど）により特徴的な代謝様式の理解がさらに深まった。
さらに、腫瘍細胞のエネルギー代謝様式もseahorse flux analyzerの解析などにより検討を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
概ね順調に研究は進行しています。CAR-T細胞、腫瘍細胞の代謝様式を理解したうえで、今後はより有効なCAR-T細胞治療法に結び付く方法論を具体化していく予定です。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度の知見に加え、当該年度では、seahorse flux analyzerによる解析を導入したため当初の解糖優位かミトコンドリアでの酸化的リン酸化優位かという2者択一的な捉え方ではなく、ミトコンドリア機能が保たれることがCAR-T細胞の機能（標的細胞傷害活性）につながっているのではないかと考えるに至ってきました。
今後は、標的細胞との共培養（あるいは標的抗原刺激）時に各種代謝阻害薬、グルコース不含（あるいは低グルコース）培養液の使用などを活用し、CAR-T細胞の機能とミトコンドリア機能（seahorseでの酸素消費速度、ミトコンドリア体積、膜電位あるいはミトコンドリア関連遺伝子の発現）との関連についても検討していきます。免疫不全マウスを用いた治療モデルでの研究も予定しています。糖質制限食（高脂質食）による治療効果への影響も検討していきます。
現在、CD19 CARについて検討していますが、今後固形がんへの応用を視野にCEA CARについても検討する予定です。
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| Causes of Carryover |
試薬等は比較的余裕があり、購入が予定を下回ったところもあります。次年度は動物実験等の予定もあり、当該金額も併せて使用する予定です。
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