2019 Fiscal Year Research-status Report
初期エンドソームの機能破綻に着目した神経変性疾患発症機構の解析
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19K07832
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
大友 麻子 東海大学, 医学部, 助教 (50535226)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
秦野 伸二 東海大学, 医学部, 教授 (60281375)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 初期エンドソーム / 神経変性疾患 / シグナル伝達 / ALS / AD |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内に取り込まれた物質は初期エンドソームと呼ばれる膜小胞上で選別を受けて、分解経路へ輸送される分子と、再利用経路を介して細胞膜やゴルジ体に輸送される分子に振り分けられる。この初期エンドソームを中心とした物流システムの破綻は、がん、アルツハイマー病などの神経変性疾患、免疫疾患など多様な疾患の原因となっている。従って、この細胞内物流システムを分子レベルで理解することは前述の疾患を理解するためにも重要である。そこで本研究は、初期エンドソームを中心とした物流システムの分子的背景を理解し、その異常と神経変性疾患発症との関わりを明らかにすることを目的とする。EEの機能破綻の原因として、低分子量Gタンパク質Rab5の活性化の亢進があるとされるが、具体的な分子メカニズムは明らかにされていない。そこで、本研究は、Rab5の活性化の亢進の背景にある分子群を同定し、そのメカニズムを理解することを目指す。
本年度は、申請計画に従って、Rab5の活性化の亢進に着目したエンドソーム機能破綻を再現する細胞モデルの作出と検討及び、それをサンプルとして用いたBioID法によるビオチンリガーゼ融合活性化Rab5依存的にビオチン標識されるタンパク質のアフィニティー精製の条件検討を行った。その結果、2種類のエンドソーム機能破綻モデル細胞の作出に成功した。次に、これらのモデル細胞を用いて、BioID法によるビオチン標識タンパク質のアフィニティー精製の条件検討を行った結果、細胞の膜画分を分画し、サンプルとして用いてアフィニティー精製を行うことにより、非特異的もしくは内在性ビオチン化タンパク質の回収を減らし、膜画分に特異的な活性化Rab5発現結合タンパク質の検出に成功した。よって、これらのタンパク質を質量分析によって解析することによって同定が可能であると示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、申請計画に従って、エンドソーム(EE)機能破綻モデル細胞の作製とそれをサンプルとして用いたBioID法によるビオチン標識タンパク質のアフィニティー精製の条件検討を行い、概ね目的を達成した。
1.EE機能破綻モデルの作製
EE機能破綻モデル作製に必要な発現コンストラクトBioID-Rab5WT, BioID-Rab5CA, BioID-Rab5DNを作製した。予備実験として、HeLa細胞にトランスフェクションし、その発現をウエスタンブロット解析によって確認した。本年度は、BioID-Rab5ＣＡの発現によってEEを肥大化させ機能破綻させたモデル及びBioID-Rab5発現細胞に3-methyladenine（３MA）などのPI3キナーゼ阻害剤で処理し、EEの輸送阻害による機能破綻モデルを作製した。両モデル細胞ともにEEの肥大化による、各種マーカー分子のEEへの蓄積が確認された。よって、これらをEE機能の破綻モデルとして実験に用いることとした。
2.BioID法によるビオチン標識タンパク質のアフィニティー精製の条件検討
EE機能破綻モデル細胞を回収し、8MUrea, ２%TritonX-100を含む溶液で、可溶化後、アビジンビーズを用いたビオチン化タンパク質のアフィニティー精製を行った。SDS-PAGE後に銀染色を行った結果、BioID-Rab5ＣＡの発現に依存して、特異的にビオチン化を受けるタンパク質の存在を確認したが、内在性ビオチン化タンパク質や、BirA（ビオチンリガーゼ）単独発現に依存してビオチン化を受けるタンパク質が多く存在し、タンパク質同定には至らなかった。そこで、EE破綻モデル細胞を細胞質画分と膜画分、及び核画分に分離し、アフィニティー精製を試みた。その結果、膜画分特異的に、BioID-Rab5ＣＡによってビオチン化を受けるタンパク質の濃縮に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は、膜画分に存在するBioID-Rab5CA依存的にビオチン化を受けるタンパク質に着目し、その分子の同定を質量分析によって試みる。また、初年度では、HeLa細胞を用いて、実験系の確立を行った。しかし、神経変性疾患とEE機能異常の関連を明らかにすることを目的としているため、用いる細胞を神経系由来の細胞に変えて、同様の実験を行い、非神経系細胞との違いがについても検証する。
BioID法によるRab5相互作用分子の同定：アフィニティー精製後のビオチン化タンパク質を、SDS-PAGEによって分離し、銀染色を行った後に切り出したゲルを質量分析に用いる。それにより、タンパク質を同定する。モデル細胞以外に、同時に、BioID-Rab5のみを発現させたサンプルからも、ビオチン化タンパク質を精製し、同手法によって結合タンパク質としてみなし、コントロールとする。EE破綻モデルサンプルから同定したタンパク質群からコントロール群を除いたものを、EE肥大化関与分子として、質量分析による同定を試みる。
機能解析によるスクリーニング：候補分子に対する特異的な抗体を用いて、Rab5とのPLA による初期エンドソームでの相互作用解析を行い、候補分子がエンドソームに局在する分子であることを確認する。また、既知のRab5結合分子として報告されているかどうかを確認し、既知分子の場合は、分子の機能について情報収集を行う。未知の分子の場合は、候補分子をノックダウンすることによって、初期エンドソーム動態に与える影響について解析を行う。もし、未知の結合分子が同定できない場合は、疾患特異的なエンドソーム機能破綻モデルを作製し、再度検討を行う計画である。
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| Causes of Carryover |
2019年度の末に海外出張を予定し、手配をしていたが、コロナウイルス感染症の影響により、学会の開催がキャンセルとなった。分担者についても類似した状況となり、出張自体の計画の変更を余儀なくされた。それに伴い、予定していた海外出張及び国内旅費に関わる費用を使用することが出来なかった。この分の研究費を本年度に持ち越し、可能であれば海外出張、もしくは国内における学会発表の費用として使用する計画である。学会発表が難ししい状況が続く場合は、今年度も論文投稿による成果発表を予定しているため、一部の研究費は論文投稿費用に用いる計画である。また、本年度は質量分析によるタンパク質同定を行う計画である。場合によっては、受託研究費として使用する研究費が現在の予定より上回ることも考えられるため、一部を受託研究費として用いる計画である。
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