2020 Fiscal Year Research-status Report

NASH発症におけるRAGE発現亢進のメカニズム解明と肝線維化マーカー開発

Research Project

Project/Area Number	19K07914
Research Institution	Kochi University
Principal Investigator	廣瀬享高知大学, 教育研究部医療学系臨床医学部門, 講師 (30457395)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	越智経浩高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 助教 (30617840) 小野正文高知大学, 教育研究部医療学系臨床医学部門, 准教授 (70304681)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	NAFLD / 肝線維化 / RAGE
Outline of Annual Research Achievements	これまで我々は、NASH患者および動物モデルの肝臓でRAGE発現が亢進し、RAGE欠損マウスでNASHの肝線維化進展が抑制される事を報告し、AGE-RAGE系がNASHの病態進展に重要な役割を果たしている事を明らかにしてきた。しかし、その分子メカニズムなどの詳細は十分に解明されていない。そこで、肝線維化シグナル伝達およびSGE-RAGE系シグナル伝達の活性化状態、さらに両シグナルのクロストークについて検討を行った。mDia1(Mannmalian diaph 1)は、細胞骨格に関連する蛋白であり、RAGEに対しての膜結合蛋白である。コントロール食ではMTマウスと比べてRAGE KOマウスにおいてRAGEのRNA発現量は低下していた。さらにMCD食負荷によりWTマウスではRAGEのRNA発現量は増加するのに対して、RAGE KOマウスではMCD食負荷によりRAGEのRNA発現量は増加せず、WTと比べて有意に発現量は低値であった。また肝でのTgf-β1、Ctgf、α-Sma、type 1 collagen-α1、Timp-1、Tnf-α、Nos2の発現量は、RAGE KOマウスでは有意に抑制された。また肝組織中のmDia1は蛋白発現についてウエスタンブロット法および免疫染色で評価したところ、RNAの発現量と同様に蛋白の発現量は低値であった。NAFLDの肝線維化進展においてRAGEからmDia1を介したシグナル伝達経路が重要であることが明らかになった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason NASHの病態および肝線維化進展において重要な役割を果たしているRAGEについて、肝臓内における発現調整について検討を行った。メチオニンコリン欠乏食（MCD食）を投与したNASHモデル（WT-MCDマウス）肝では明らかな肝脂肪化および線維化を来たし、肝線維化マーカー（type 1 collagen-α1、Timp-1）、炎症性マーカー（Tnf-α、Nos2）及びRAGEは有意に高発現していた。またAT1受容体拮抗薬（ARB）により発現が抑制されることから、RAGEの遺伝子発現はRAS系によりregulationされている事が示唆された。MCD食を投与したRAGE-KOマウスの肝線維化は有意に抑制され、肝でのTgf-β1、Ctgf、α-Sma、type 1 collagen-α1、Timp-1、Tnf-α、Nos2の発現量は有意に抑制された。RAGEの下流に存在するmDie1の肝におけるRNA発現量および蛋白の発現量を評価したところ、WT-MCDマウスではmDia1は高発現しているのに対して、RAGE-KO-MCDマウスでのRNA発現量および蛋白発現量はWT-MCDマウスに比べ低下していた。NAFLDの肝線維化進展においてRAGEからmDia1を介したシグナル伝達経路が重要であることが明らかになった。本年度の予定としては概ね良好な進捗状況である。
Strategy for Future Research Activity	RAGEと下流のシグナル伝達経路の活性化は、NAFLDの線維化進展を引き起こす。RAGEは主に肝星細胞とクッパ-細胞に発現していると報告されている。NAFLDモデルマウスにおいてのRAGEおよびRAGEに対しての膜結合蛋白であるmDia1の肝での発現の局在を免疫染色により明らかにする。さらにmDia1の発現は、RAGEの下流のシグナル伝達経路と肝線維症の進行を規定している可能性があり、RAGEからmDie1、Akt、Erk、Egr-1を介したシグナル伝達経路の活性化についても検討する。
Causes of Carryover	WT-MCDマウスおよびRAGE-KO-MCDマウスにおけるRAGE、mDai1の肝での発現を免疫染色で検討する。mDia1はRAGEに対しての膜結合蛋白であるので、免疫二重染色を行うことでRAGEとmDia1の発現する細胞を同定することでNAFLDにおけるmDia1とRAGEの制御メカニズムを検討する。肝組織における免疫組織学的検討を行うため多くの材料費が必要である。また、これまでの成果を論文化し、国内外の学会に発表するため、その申請費、旅費が必要である。