2020 Fiscal Year Research-status Report
サイトカイン遺伝子の一塩基多型解析とEVを用いた難治性ITPの早期診断法の開発
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19K07948
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
野村 昌作 関西医科大学, 医学部, 教授 (20218358)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伊藤 量基 関西医科大学, 医学部, 准教授 (70434826)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ITP / EV / サイトカイン遺伝子 / 樹状細胞 / SNP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
免疫性血小板減少症(ITP)ではステロイドを中心とした治療薬の適正な使用が、その後の臨床経過を左右しているが、難治性のITPに関する対策は未だ完全ではない。本研究ではこれら難治性のITPを早期に診断して適切な治療ストラテジーを構築するためにExtracellular vesicle (EV)とサイトカイン遺伝子の一塩基多型(SNP)解析を組み合わせた早期診断システムの開発を行うことを目的としている。令和2年度の研究では、ITP患者におけるサイトカインのSNP解析を行った。まずITP症例からのDNA抽出を行い、シーケンスに特有のプローブを含むOneLamda社のキットによるPCR-SSP方法を使用して、サイトカイン遺伝子多型を決定した。なおサイトカイン関連遺伝子としては、①TNFα(-308)*G/A ②IL-10 (-1082)*G/A、(-819)*C/T、(-592)*C/A ③IFNγ(+874)*T/A ④TGFβ(コドン10,25) の4つを対象とした。測定の結果、ITPでは、TGF-β1 +869 C/C genotype の頻度が健常コントロールに比較して有意に低値であった。一方ITPに対する治療反応性に関しては、The IL-10 −592 C/C と A/A, −819 C/C と T/T, さらに −1082, −819, −592 ATA/ATA genotypesの頻度ステロイドの反応性に有意に関連していることが判明した。以上の結果より、ITPの病態および治療反応性にはサイトカイン遺伝子多型が関与している事が明確となり今後の本研究の遂行に伴う治療の反応性とEVに関するデータを組み込むことによって、難治性ITPの早期診断および適切な治療ストラテジーの構築に結びつく可能性が高いことが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ITP症例のサイトカイン遺伝子多型の検討は当初の計画よりもはるかに順調に進行しており、令和2年度に目標症例をほぼ達成できた状態である。その結果、ITP患者のTGF-β1 +869 C/C genotype の頻度が健常コントロールに比較して有意に低値であることが判明した。またITPに対する治療反応性に関してもステロイドの反応性とサイトカイン遺伝子多型との関連性について新たな知見を得ることができた。今後は、難治性ITPに対するトロンボポエチン受容体作動薬(エルトロンボパグ)の反応性とサイトカイン遺伝子多型との関連性について検討を進める予定である。一方ITPでは、抗血小板抗体の生成および抗体の結合した血小板の破壊のメカニズムにおいて単球・マクロファージの活性化が重要な役割を果たしている。したがって、本研究においても単球・マクロファージ系の培養細胞であるTHP-1を用いた研究がメインテーマの一つになっている。活性化したTHP-1からのEVの構造解析は順調に進んでおり、今後はEVが巨核球や血管内皮細胞に対してどのようなメカニズムでシグナルを伝達しているかの検討が鍵を握ると考えて実験を進めているところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
進捗状況で述べたように、ITP症例のサイトカイン遺伝子多型の検討は順調に進んでいる。令和3年度には、EVの構造解析およびITPにおける標的細胞の検討を終えて、EVの樹状細胞(DC)免疫誘導ならびにサイトカイン産生の研究につなげたいと考えている。そのために、EVの構造解析およびITPにおける標的細胞の検討と並行して、EVの樹状細胞(DC)免疫誘導ならびにサイトカイン産生の研究を早期に完成させたいと考えている。すなわち、純化した2種類のヒトDC亜群と3種類のEVを組み合わせて、それぞれを培養し、各DC亜群の成熟活性化度合いに関してCD40,CD40L, CD80, CD86, CD83の発現をフローサイトメーターで解析したいと考えている。また、ITP患者の治療経過に基づく患者の層別解析、特に難治性ITPに対するトロンボポエチン受容体作動薬(エルトロンボパグ)の反応性とサイトカイン遺伝子多型との関連性についても並行して実施したいと考えている。
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| Causes of Carryover |
令和２年度の研究については、おおむね順調に進んでいたが、COVID-19の影響により、入手困難な試薬や納期の遅延等があった為、令和３年度の入手後に使用を予定している。
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