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2019 Fiscal Year Research-status Report

Proteins interacting with Nav1.1 may be potential therapeutic targets for epilepsy

Research Project

Project/Area Number 19K08284
Research InstitutionNippon Medical School

Principal Investigator

荻原 郁夫  日本医科大学, 医学部, 准教授 (30373286)

Project Period (FY) 2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords電位依存性ナトリウムチャネル / タンパク複合体 / てんかん / 自閉症
Outline of Annual Research Achievements

電位依存性ナトリウムチャネルの細胞膜発現やチャネル機能の制御機構については不明な点が多く残されている。本研究課題の目的は電位依存性ナトリウムチャネルNav1.1と複合体を形成する分子のNav1.1制御機構における役割を明らかにし、てんかんと自閉症の治療開発に貢献することである。
電位依存性ナトリウムチャネルのαサブユニットは4つの6回膜貫通ドメインから構成される250 kDのタンパク質で、N末端とC末端、そして3か所のドメイン間ループが細胞質側にある。これら細胞質側ドメインのうち、推定上のリン酸化部位があるI-IIループとEFハンド様モチーフを形成するC末端をNav1.1側相互作用領域として選定し、この2領域のHAタグ付き発現ベクターを作製した。同時に、以前の液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法で同定した候補タンパクA, B, CのV5タグ付き発現ベクターを作製した。また、陽性コントロールとしてNav1.1のC末端との相互作用が既知のカルモジュリンを用意した。これら発現ベクターをHEK293細胞に共トランスフェクションして細胞抽出液を調整し、HAあるいはV5タグの抗体で免疫沈降を施行した。そして、免疫沈降産物についてウエスタンブロット法を施行した。その結果、候補タンパクAとBはI-IIループを介してNav1.1と相互作用することが示唆された。一方、候補タンパクCはI-IIループとC末端のどちらにも結合しないことが示唆された。カルモジュリンは、報告の通り、Nav1.1とC末端と結合した。また、全長Nav.1.1発現ベクターでも同様の実験を行ったが、全長Nav1.1の発現量が極めて低いことが原因で、相互作用は検出できなかった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

候補タンパクAについて、Nav1.1との相互作用を確認し、その部位がI-IIループであることを明らかにした。候補タンパクBについて、これまでの他のチャネル研究からC末端に結合すると予想したが、Nav1.1ではI-IIループが相互作用部位であることを明らかにした。これらタンパクAとBがNav1.1のキネティクスに及ぼす影響の解析もセットした。以上のことから、計画はおおむね順調に推移しているということができる。

Strategy for Future Research Activity

タンパクAとBがNav1.1の局在やキネティクスに及ぼす影響をHEK293細胞や初代神経培養細胞を用いて、分子細胞生物学ならびに電気生理学的に解析する。全長Nav1.1は強制発現系では発現量が少ない。近年、強制発現系における翻訳能率を最適化するコドンパターンの報告があり、全長Nav1.1への導入を検討している。

Causes of Carryover

(理由)牛胎児血清を含む細胞培養関連試薬やトランスフェクション関連試薬、PCR関連試薬は大学研究室配分研究経費で購入したものの中から一部を使用させてもらった。免疫沈降法の抗体ビーズとウエスタンブロットのPVDFメンブレンは以前の研究プロジェクトで購入して残っていたものから使用した。
(使用計画)細胞培養関連試薬、電気泳動用ゲル、抗体、トランスフェクション関連試薬、標本作製用器具、電気生理学的解析試薬、siRNA、PCR関連試薬を購入する。

  • Research Products

    (10 results)

All 2020 2019 Other

All Journal Article (1 results) (of which Peer Reviewed: 1 results,  Open Access: 1 results) Presentation (8 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Impaired cortico-striatal excitatory transmission triggers epilepsy2019

    • Author(s)
      Miyamoto Hiroyuki、Tatsukawa Tetsuya、Shimohata Atsushi、Yamagata Tetsushi、Suzuki Toshimitsu、Amano Kenji、Mazaki Emi、Raveau Matthieu、Ogiwara Ikuo、Oba-Asaka Atsuko、Hensch Takao K.、Itohara Shigeyoshi、Sakimura Kenji、Kobayashi Kenta、Kobayashi Kazuto、Yamakawa Kazuhiro
    • Journal Title

      Nature Communications

      Volume: 10 Pages: 1917

    • DOI

      https://doi.org/10.1038/s41467-019-09954-9

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] Identification of binding partners of the voltage-gated sodium channel Nav1.12020

    • Author(s)
      Ogiwara I.
    • Organizer
      第97回日本生理学大会
  • [Presentation] Involvement of the C-terminal domain in cell surface expression and G-protein coupling of mGluR62020

    • Author(s)
      Shimohata A, Rai D, Akagi T, Ishii T, Gangi M, Maruyama T, Kiyama Y, Ogiwara I, Kaneda M.
    • Organizer
      第97回日本生理学大会
  • [Presentation] Membrane expression of mGluR6 transfected cultured retinal bipolar cells2020

    • Author(s)
      Akagi T, Shimohata A, Ogiwara I, Kaneda M.
    • Organizer
      第97回日本生理学大会
  • [Presentation] Identification of proteins that interact with the voltage-gated sodium channel Nav1.12019

    • Author(s)
      Ogiwara I.
    • Organizer
      第42回日本神経科学大会
  • [Presentation] Impaired excitatory neurotransmission in epilepsy, intellectual disability, autism and schizophrenia caused by sodium channel gene SCN2A mutations2019

    • Author(s)
      Yamakawa K, Miyamoto: H, Tatsukawa T, Yamagata T, Raveau M, Ogiwara I.
    • Organizer
      第42回日本神経科学大会
  • [Presentation] Altered hippocampal replay underlies memory impairments in SCN2A heterozygous mice2019

    • Author(s)
      Middleton SJ, Kneller EM, Chen S, Ogiwara I, Yamakawa K, McHugh TJ.
    • Organizer
      第42回日本神経科学大会
  • [Presentation] Roles of the C-terminal domain in cell surface expression of mGluR62019

    • Author(s)
      Akagi T, Dilip R, Shimohata A, Ishii T, Gangi M, Maruyama T, Ogiwara I, Kaneda M.
    • Organizer
      第42回日本神経科学大会
  • [Presentation] 遺伝子変異マウスを用いたSCN2A遺伝子関連てんかんの発症機序解明2019

    • Author(s)
      荻原 郁夫
    • Organizer
      第7回日本医科大学包括てんかん診療ミーティング(NMS-ENM)学術集会
  • [Remarks] てんかん発症の新たな神経回路を発見

    • URL

      https://www.riken.jp/press/2019/20190516_1/

URL: 

Published: 2021-01-27  

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