2020 Fiscal Year Research-status Report
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19K08481
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
光山 慶一 久留米大学, 医学部, 教授 (20200066)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山崎 博 久留米大学, 医学部, 助教 (20529565)
吉岡 慎一郎 久留米大学, 医学部, 助教 (90425190)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ACP353 / TCP353 / AIEC / クローン病 / バイオマーカー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1) 各種E.coli株を溶解し、ウェスタンブロット法でACP353抗体との反応性確認した。その結果、いずれも多数のバンドが見られるが、AIECに特異的なものは判別できなかった。さらに抗原であるTCP353ペプチドを添加して吸収実験を実施したが、特に変化はみられなかったことから、ほぼ全て非特異反応と推察された。
2) THP-1から分化誘導したマクロファージ様細胞に各種E.coli株を感染させ、ウェスタンブロット法でACP353抗体との反応性を確認したが、非常に弱いシグナルのバンドが数本見られるのみで、AIEC特異的なものはみられなかった。さらにTCP353ペプチドを添加して吸収実験を実施したが、変化はみられなかった。次に各種サイトカイン産生の測定すると、IL-6とTNF-α産生が増加したが、コントロール（JM105）とAIECでは差異はなかった。さらにTCP353ペプチド添加による各種サイトカイン産生への影響を検討すると、TCP353ペプチドの添加によりIL-6とTNF-αの増加はみられなかったが、AIEC感染細胞ではTCP353ペプチド濃度依存的に、IL-6とTNF-α産生はむしろ減少した。JM105感染細胞ではほとんど変化はなかった。
今回の結論として、本実験系ではSW480細胞へのAIECの結合は、コントロール（JM105）と比較して高いことは観察されたが、細胞内でのAIEC増殖が再現されなかった。また菌体、感染細胞を用いて、ACP353抗体によるウェスタンブロットを実施したが、特徴的なシグナルは見られらなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ホモロジー検索でのアプローチとしては、クローン病では、自己抗原だけでなく、腸内の共生細菌や真菌の抗原、および食物抗原に対する免疫寛容が破綻していると言われているため、生物種を限定せずにCXXGLFPN配列にてホモロジー検索を実施し、ヒット配列の中から、腸内の共生細菌や真菌の抗原、および食物抗原を抽出することを試みた。しかしながら、ヒット数が多いため、作業は容易ではなかった。そこで、ヒト由来のペプチドNo.125（CSLGLFPN）を参考にしてのホモロジー検索も実施した。
その結果、クローン病患者血清が強く反応するCXXGLFPN配列は、ヒト、共生細菌、寄生虫由来のタンパク質中に存在することが分かった。また、上記の配列の中で飛びぬけて反応性の良いものはないため、いずれもACP353の真の対応抗原ではなく、単に交差反応性を有しているだけの可能性は残る。
さらに別のアプローチとして、TCP353とその対応抗原の候補であるAIECとの関連を調べた。まず、通気性または嫌気性培養した各種E.coli株とACP353抗体との反応性確認として、a) ウェスタンブロット法と、b) 菌体固相化プレートとACP353抗体とのEIAを実施した。
次に、THP-1から分化誘導したマクロファージ様細胞に各種E.coli株を感染させ、a) マクロファージ／E.coliを溶解し、ウェスタンブロット法でACP353抗体との反応性確認、b) 各種サイトカイン産生の測定、およびc) TCP353ペプチド添加による各種サイトカイン産生への影響についても検討した。
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| Strategy for Future Research Activity |
TCP353のホモロジー検索による検討では、オリジナルのTCP353よりもクローン病患者検体と強く反応する配列が複数見つかったのは収穫であったが、ACP353の対応抗原をズバリ同定するには至っていない。クローン病では、自己抗原だけでなく、腸内の共生細菌や真菌の抗原、および食物抗原に対する免疫寛容が破綻していると言われている。したがって、ヒト以外の生物種由来のタンパク質がACP353の対応抗原かもしれなく、その場合、まだデータベースに登録されていない可能性もありうる。以上から、これまで検討したアミノ酸配列の中で飛びぬけて反応性の良いものはないため、いずれもACP353の真の対応抗原ではなく、単に交差反応性を有しているだけの可能性は残る。対応抗原の同定はかなり難易度の高い作業と考えられるが、今後も丹念に検討を続けていく予定である。
TCP353とその対応抗原の候補であるAIECについての追加実験としては、今後、健常人またはCD、UC患者由来のPBMCに各種E.coli株を感染させて各種解析を行い、AIEC感染により腸炎を発症したマウスの血清中にACP353が検出されるか等を検討していく予定である。
これまでに得られている結果はACP353と腸管免疫との関係を示唆しているようにも考えられる。ACP353とAIECとの関連が証明できれば、ACP353を、将来出てくるであろうAIECを標的とした治療を選択するための診断薬にできるかもしれない。
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| Causes of Carryover |
TCP353とその対応抗原の候補であるAIECとの関連を調べるために、まず通気性または嫌気性培養した各種E.coli株とACP353抗体との反応性確認のため、a) ウェスタンブロット法と、b) 菌体固相化プレートとACP353抗体とのEIAを実施した。
次に、THP-1から分化誘導したマクロファージ様細胞に各種E.coli株を感染させ、a) マクロファージ／E.coliを溶解し、ウェスタンブロット法でACP353抗体との反応性確認、b) 各種サイトカイン産生の測定、および c) TCP353ペプチド添加による各種サイトカイン産生への影響についても検討した。いずれにおいても、単一の感染時間だけでは、予想通りの結果が得られず、感染時間等を延長する追加実験が必要であった。
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[Journal Article] Diagnostic accuracy of serum proteinase 3 antineutrophil cytoplasmic antibodies in children with ulcerative colitis2021
Author(s)
Tatsuki Mizuochi,Katsuhiro Arai,Takahiro Kudo,Ryusuke Nambu,Hitoshi Tajiri,Tomoki Aomatsu,Naoki Abe,Toshihiko Kakiuchi,Kunio Hashimoto,Tsuyoshi Sogo,Michiko Takahashi,Yuri Etani,Yugo Takaki,Ken-Ichiro Konishi,Jun Ishihara,Hitoshi Obara,Tatsuyuki Kakuma,Shunsuke Kurei,Yushiro Yamashita,Keiichi Mitsuyama
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Journal Title
Journal of Gastroenterology and Hepatology
Volume: 36
Pages: 1538-1544
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Therapeutic Potential of a Self-Assembling Peptide Hydrogel to Treat Colonic Injuries Associated with Inflammatory Bowel Disease2021
Author(s)
Araki T, Mitsuyama K, Yamasaki H, Morita M, Tsuruta K, Mori A, Yoshimura T, Fukunaga S, Kuwaki K, Yoshioka S, Takedatsu H, Kakuma T, Akiba J, Torimura T.
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Journal Title
Journal of Crohn's and Colitis
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Evaluation of Serum Luecine-rich Alpha-2 Glycoprotein as a New Inflammatory Biomarker of Inflammatory Bowel Disease2021
Author(s)
Yoshimura T, Mitsuyama K, Sakemi R, Takedatsu H, Yoshioka S, Kuwaki K, Mori A, Fukunaga S, Araki Y, Morita M, Tsuruta K, Yamasaki H, Torimura T
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Journal Title
Mediators of Inflammation
Volume: 8825374
Pages: 1-10
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Altered serum profile of the interleukin-22 system in inflammatory bowel disease2020
Author(s)
Sakemi R, Mitsuyama K, Morita M, Yoshioka S, Kuwaki K, Tokuyasu H, Fukunaga S, Mori A, Araki T, Yoshimura T, Yamasaki H, Tsuruta K, Morita T, Yamasaki S, Mizoguchi A, Sou S, Torimura T
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Journal Title
Cytokine
Volume: 136
Pages: 155264
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Highly bioavailable curcumin derivative ameliorates Crohn's disease symptoms: A randomized, double-blind, multicenter study2020
Author(s)
Sugimoto K, Ikeya K, Bamba S, Andoh A, Yamasaki H, Mitsuyama K, Nasuno M, Tanaka H, Matsuura A, Kato M, Ishida N, Tamura S, Takano R, Tani S, Osawa S, Nishihira J, Hanai H
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Journal Title
Journal of Crohns & Colitis
Volume: 14
Pages: 1693-1701
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Safety and efficacy of single-needle leukocyte apheresis (LCAP) for treatment of ulcerative colitis2020
Author(s)
Shindo Y, Mitsuyama K, Yamasaki H, Imai T, Yoshioka S, Kuwaki K, Yamauchi R, Yoshimura T, Araki T, Morita M, Tsuruta K, Yamasaki S, Fukami K, Torimura T
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Journal Title
Therapeutic Apheresis and Dialysis
Volume: 24
Pages: 503-510
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Gene Expression of Transient Receptor Potential Channels in Peripheral Blood Mononuclear Cells of Inflammatory Bowel Disease Patients2020
Author(s)
Morita T, Mitsuyama K, Yamasaki H, Mori A, Yoshimura T, Araki T, Morita M, Tsuruta K, Yamasaki S, Kuwaki K, Yoshioka S, Takedatsu H, Torimura T
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Journal Title
Journal of Clinical Medicine
Volume: 9
Pages: 2643
DOI
Peer Reviewed
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