iPS細胞を用いた致死性遺伝性不整脈疾患の病態解明、治療法開発

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K08538
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 牧山 武 京都大学, 医学研究科, 特定講師 (30528302)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 不整脈 / 遺伝子 / iPS細胞 / 心筋細胞 / 心筋症 / 疾患モデル

Outline of Annual Research Achievements

当該年度は、iPS細胞モデルを用いた遺伝性不整脈疾患の病態解明、治療法開発研究に関して、以下の研究を行った。
遺伝性不整脈疾患（QT延長症候群、QT短縮症候群、カテコラミン誘発性多形性心室頻拍、早期再分極症候群、LMNA関連心筋症、家族性洞不全症候群等）に関してiPS細胞モデルを用いた解析を行った。解析に関しては、CRISPR-Cas9システムを用いたゲノム編集技術を用いて一塩基変異ノックインiPS細胞株やgene correctionを行ったisogenicなコントロールを作製、一塩基異常による機能異常を正確に解析する系を構築し、遺伝子発現、Ca動態計測、活動電位計測、収縮能測定の機能解析をすすめた。特に、カルモジュリン遺伝子変異を有するカテコラミン誘発性多形性心室頻拍症例より作製したiPS細胞由来分化心筋細胞においては、活動電位記録において、ベースラインより異常な早期後脱分極、遅延後脱分極を認め、イソプロテレノール負荷にてさらに催不整脈性が増強した。Ca動態記録では、筋小胞体からのCaイオンリークを認め、カルモジュリン変異によるリアノジン受容体機能異常（機能亢進）が原因であると推察された。これらの結果は患者表現型の重症度に合致する所見であった。また、カルモジュリンはL型カルシウムチャネルの不活性化に重要な働きがあることが知られているが、分化心筋細胞におけるL型カルシウムチャネル電流記録では、有意なキネティクスの変化を認めなかった。本疾患に関しては、更なる病態解明のためカルモジュリン（野生型、変異型）とリアノジン受容体の結合能に関する実験を進行中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

各疾患モデルにおいて、ゲノム編集技術を用いた一塩基置換iPS細胞株の作製、また、変異iPS細胞株のgene correctionを行い、分化心筋細胞における催不整脈性の評価、薬効評価をすすめている。進行状況はおおむね順調であると考える。

Strategy for Future Research Activity

引き続き遺伝性不整脈・心筋症において疾患特異的iPS細胞モデルの確立、疾患発症機序の解明、治療法開発を目指した研究を進める。電気生理学的機能解析に関しては、96ウェルプレートにおいてペーシング刺激電極を用いたハイスループットな解析系を立ち上げておりスムーズな解析を行う。
上述のカルモジュリン変異によるカテコラミン誘発性多形性心室頻拍のiPS細胞モデルに関しては、生化学実験（変異カルモジュリンのCaイオンに対する結合能、リアノジン受容体に対する結合能）を予定、進行中であり、巨大なリアノジン受容体蛋白の精製に関して、創薬等先端技術支援基盤プラットフォーム（BINDS）の支援を受けている。実際のカルモジュリン-リアノジン受容体の結合能評価に関しては、バイオセンサー技術を用いたハイスループットな生体分子間相互作用解析システム（Octetシステム）を利用し、リアルタイムな結合能を高感度で測定し、変異カルモジュリンがリアノジン受容体に及ぼす詳細なメカニズムの解明を目指す。また、iPS細胞モデルにおいては、候補治療薬の膜電位イメージング、Caイメージングを用いた薬効評価を行う。

Causes of Carryover

covid 19の影響による一時的な研究縮小のため次年度使用額が生じたが、2021年度の研究に使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Impact of the T-wave characteristics on distinguishing arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy from healthy children (2021)
  • Author(s): Imamura Tomohiko、Sumitomo Naokata、Muraji Shota、Yasuda Kazushi、Nishihara Eiki、Iwamoto Mari、Tateno Shigeru、Doi Shozaburo、Hata Tadayoshi、Kogaki Shigetoyo、Horigome Hitoshi、Ohno Seiko、Ichida Fukiko、Nagashima Masami、Makiyama Takeru、Yoshinaga Masao
  • Journal Title: International Journal of Cardiology Volume: 323 Pages: 168～174
  • DOI: 10.1016/j.ijcard.2020.08.088
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Corrigendum to “A challenge for mutation specific risk stratification in long QT syndrome type 1” [J. Cardiol. 72(1) (2018) 56?65] (2021)
  • Author(s): Yagi Noriaki、Itoh Hideki、Hisamatsu Takashi、Tomita Yukinori、Kimura Hiromi、Fujii Yusuke、Makiyama Takeru、Horie Minoru、Ohno Seiko
  • Journal Title: Journal of Cardiology Volume: 77 Pages: 322～326
  • DOI: 10.1016/j.jjcc.2020.09.008
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Propranolol Attenuates Late Sodium Current in a Long QT Syndrome Type 3-Human Induced Pluripotent Stem Cell Model (2020)
  • Author(s): Hirose Sayako、Makiyama Takeru、Melgari Dario、Yamamoto Yuta、Wuriyanghai Yimin、Yokoi Fumika、Nishiuchi Suguru、Harita Takeshi、Hayano Mamoru、Kohjitani Hirohiko、Gao Jingshan、Kashiwa Asami、Nishikawa Misato、Wu Jie、Yoshimoto Jun、Chonabayashi Kazuhisa、Ohno Seiko、Yoshida Yoshinori、Horie Minoru、Kimura Takeshi
  • Journal Title: Frontiers in Cell and Developmental Biology Volume: 8 Pages: 761
  • DOI: 10.3389/fcell.2020.00761
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Transethnic Genome-Wide Association Study Provides Insights in the Genetic Architecture and Heritability of Long QT Syndrome (2020)
  • Author(s): Lahrouchi N, Tadros R, Crotti L, Makiyama T et al.
  • Journal Title: Circulation Volume: 142 Pages: 324～338
  • DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.120.045956
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Enhancing rare variant interpretation in inherited arrhythmias through quantitative analysis of consortium disease cohorts and population controls (2020)
  • Author(s): Walsh R, Lahrouchi N, Tadros R, Makiyama T et al.
  • Journal Title: Genetics in Medicine Volume: 23 Pages: 47～58
  • DOI: 10.1038/s41436-020-00946-5
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] SCN5A mutation identified in a patient with short‐coupled variant of torsades de pointes (2020)
  • Author(s): Sonoda Keiko、Ohno Seiko、Shimizu Yukiko、Kaitani Kazuaki、Makiyama Takeru、Nakagawa Yoshihisa、Horie Minoru
  • Journal Title: Pacing and Clinical Electrophysiology Volume: 43 Pages: 456～461
  • DOI: 10.1111/pace.13924
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] An NGS-based genotyping in LQTS; minor genes are no longer minor (2020)
  • Author(s): Ohno Seiko、Ozawa Junichi、Fukuyama Megumi、Makiyama Takeru、Horie Minoru
  • Journal Title: Journal of Human Genetics Volume: 65 Pages: 1083～1091
  • DOI: 10.1038/s10038-020-0805-z
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] LMNA Missense Mutation Causes Nonsense-Mediated mRNA Decay and Severe Dilated Cardiomyopathy (2020)
  • Author(s): Kato Koichi、Ohno Seiko、Sonoda Keiko、Fukuyama Megumi、Makiyama Takeru、Ozawa Tomoya、Horie Minoru
  • Journal Title: Circulation: Genomic and Precision Medicine Volume: 13 Pages: 435～443
  • DOI: 10.1161/CIRCGEN.119.002853
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Telethonin variants found in Brugada syndrome, J‐wave pattern ECG, and ARVC reduce peak Na v 1.5 currents in HEK‐293 cells (2020)
  • Author(s): Turker Isik、Makiyama Takeru、Ueyama Takeshi、Shimizu Akihiko、Yamakawa Masaru、Chen Peng‐Sheng、Vatta Matteo、Horie Minoru、Ai Tomohiko
  • Journal Title: Pacing and Clinical Electrophysiology Volume: 43 Pages: 838～846
  • DOI: 10.1111/pace.13996
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] Modeling Inherited Arrhythmias Associated with Ryanodine Receptor Dysfunction using iPS Cells (2021)
  • Author(s): Takeru Makiyama, Jingshan Gao, Yuta Yamamoto, Asami Kashiwa, Takanori Aizawa, Tomohiko Imamura, Hai Huang, Hirohiko Kohjitani, Kouichi Kato, Taisuke Ishikawa, Hisaaki, Aoki, Futoshi Toyoda, Knut Wolten, Yoshinori Yoshida, Seiko Ohno, Naomasa Makita, Minoru Horie, Takeshi Kimura
  • Organizer: 第85回日本循環器学会学術集会（JCS2021）
• [Presentation] Development of an Oligonucleotide-Based Therapeutic Approach for Calmodulinopathy (2021)
  • Author(s): Takeru Makiyama, Yuta Yamamoto, Yoshiki Kondo, Jingshan Gao, Asami Kashiwa, Takanori Aizawa, Tomohiko Imamura, Hai Huang, Hirohiko Kohjitani, Taisuke Ishikawa, Yoshinori Yoshida, Seiko Ohno, Naomasa Makita, Minoru Horie, Takeshi Kimura
  • Organizer: 第85回日本循環器学会学術集会（JCS2021）
• [Presentation] iPS Cell-Based Inherited Arrhythmia Disease Modeling. iPSCs: Limitations and Future challenges. Cardiac Arrhythmias (2020)
  • Author(s): Takeru Makiyama
  • Organizer: 第84回日本循環器学会学術集会（JCS2020）
  • Invited
• [Presentation] 患者由来iPS細胞分化心筋モデルを用いた不整脈疾患の病態解析、創薬への応用 (2020)
  • Author(s): 牧山武
  • Organizer: 第97回日本生理学会大会
  • Invited
• [Presentation] Preclinical Proof-of-Concept Study: Antisense-mediated Knockdown of CALM as a Therapeutic Strategy for Calmodulinopathy (2020)
  • Author(s): Yuta Yamamoto, Takeru Makiyama, Yoshiki Kondo, Yusuke Iriyama, Ryutarou Ishikawa, Yimin Wuriyanghai, Hirohiko Kohjitani, Sayako Hirose, Jingshan Gao, Asami Kashiwa, Huang Hai, Takanori Aizawa, Tomohiko Imamura, Taisuke Ishikawa, Yoshinori Yoshida, Seiko Ohno, Minoru Horie, Naomasa Makita, Takeshi Kimura
  • Organizer: European Society of Cardiology (ESC) Congress 2020
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Inhibition of Late Sodium Current Attenuates Prolonged Action Potential Durations in CACNA1C-E1115K iPS Cell Model with Disrupted Cav1.2 ion Selectivity (2020)
  • Author(s): Asami Kashiwa, Takeru Makiyama, Hirohiko Kohjitani, Thomas Maurissen, Yimin Wuriyanghai, Yuta Yamamoto, Jingshan Gao, Hai Huang, Tomohiko Imamura, Takanori Aizawa, Taisuke Ishikawa, Seiko Ohno, Futoshi Toyoda, Seiich Sato, Kazuhiro Takahashi, Knut Woltjen, Minoru Horie, Naomasa Makita, Takeshi Kimura
  • Organizer: The Heart Rhythm Society's Annual Scientific Sessions 2020 (HRS2020)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Clinical and genetic aspects of pediatric Brugada syndrome (2020)
  • Author(s): Tomohiko Imamura, Takeru Makiyama, Hai Huang, Takanori Aizawa, Jingshan Gao, Asami Kashiwa, Yimin Wuriyanghai, Yuta Yamamoto, Yasuhiko Kohjitani, Koichi Kato, Seiko Ohno, Naokata Sumitomo, Minoru Horie.
  • Organizer: European Society of Cardiology (ESC) Congress 2020
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Human Induced Pluripotent Stem Cell Model of CACNA1C-E1115K which Impairs Ion Selectivity of the Cardiac L-type Calcium Channel (2020)
  • Author(s): Asami Kashiwa, Takeru Makiyama, Thomas Maurissen, Hirohiko Kohjitani, Yimin Wuriyanghai, Yuta Yamamoto, Jungshan Gao, Huang Hai, Tomohiko Imamura, Takanori Aizawa, Taisuke Ishikawa, Seiko Ohno, Futoshi Toyoda, Seiich Sato, Kazuhiro Takahashi, Knut Woltjen, Minoru Horie, Naomasa Makita, Takeshi Kimura.
  • Organizer: 第84回日本循環器学会学術集会（JCS2020）
• [Presentation] CALM2-N98S Mutation Associated with Long QT Syndrome Impaired the Response of KCNQ1 Channel to Beta-adrenergic Stimulation in Human iPSC-derived Cardiomyocytes. (2020)
  • Author(s): Yuta Yamamoto, Takeru Makiyama, Yimin Wuriyanghai, Hirohiko Kohjitani, Sayako Hirose, Jingshan Gao, Asami Kashiwa, Huang Hai, Takanori Aizawa, Tomohiko Imamura, Taisuke Ishikawa, Hideki Motomura, Yoshinori Yoshida, Seiko Ohno, Minoru Horie, Naomasa Makita, Takeshi Kimura.
  • Organizer: 第84回日本循環器学会学術集会（JCS2020）
• [Presentation] Preclinical Proof-of-concept of Antisense-mediated Transcript Knockdown Therapy in Calmodulinopathy (2020)
  • Author(s): Yuta Yamamoto, Takeru Makiyama, Yoshiki Kondo, Yusuke Iriyama, Ryutarou Ishikawa, Jingshan Gao, Hirohiko Kohjitani, Asami Kashiwa, Takanori Aizawa, Tomohiko Imamura, Hai Huang, Taisuke Ishikawa, Yoshinori Yoshida, Seiko Ohno, Minoru Horie, Naomasa Makita, Takeshi Kimura.
  • Organizer: 第14回日本循環器学会基礎研究フォーラム（BCVR2020）
• [Presentation] Inhibition of Late Sodium Current Attenuates Prolonged Action Potential Durations in CACNA1C-E1115K iPS Cell Model with Disrupted Cav1.2 ion Selectivity (2020)
  • Author(s): Asami Kashiwa, Takeru Makiyama et al.
  • Organizer: 第14回日本循環器学会基礎研究フォーラム（BCVR2020）
• [Presentation] 患者由来iPS細胞モデルを用いたCav 1.2イオン選択性を障害するCACNA1C-E1115K変異がQT延長症候群、Brugada症候群を発症するメカニズムの解析 (2020)
  • Author(s): Asami Kashiwa, Takeru Makiyama, Hirohiko Kohjitani, Thomas Maurissen, Yimin Wuriyanghai, Yuta Yamamoto, Jiungshan Gao, Huang Hai, Tomohiko Imamura, Takanori Aizawa, Taisuke Ishikawa, Seiko Ohno, Futoshi Toyoda, Seiich Sato, Kazuhiro Takahashi, Knut Woltjen, Minoru Horie, Naomasa Makita, Takeshi Kimura.
  • Organizer: 第97回日本生理学会大会