2019 Fiscal Year Research-status Report
遺伝性腎疾患におけるスプライシング異常症発症機序の解明および新規治療法の開発
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19K08726
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
野津 寛大 神戸大学, 医学研究科, 特命教授 (70362796)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | splicing / RNA sequence / 核酸医薬 / アンチセンス治療薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
私たちはすべての遺伝性腎疾患を対象とした網羅的遺伝子診断体制を確立し遺伝子研究を行っている。これまでの私たちの研究の結果、遺伝性腎疾患において、これまで病原性はないと判断され見過ごされていた遺伝子変異が実はスプライシング異常をきたし、それにより病気を発症する患者が少なからず存在することが明らかとなってきた。本研究においては、遺伝性腎疾患を対象とし、スプライシング異常による疾患発症メカニズムの全容の解明およびスプライシング制御による治療法の開発を行う。以下に具体的研究方法に関して列記する。次世代シークエンサーを用いた解析によりスプライシング異常が疑われる変異を同定した場合、１）末梢血白血球または患者尿中落下細胞のmRNAを抽出の上、RNAシークエンス法によりスプライシング異常の証明を行う。２）尿中落下細胞より作成した患者腎由来培養細胞および患者遺伝子配列を挿入し作成したminigeneに対し、スプライシング制御蛋白を強制発現またはsiRNAによる発現抑制を行い、スプライシングパターンの変化を観察することで、スプライシング異常の発症機序および関与する蛋白の解明を行う。３）同実験系を用い、アンチセンスオリゴヌクレオチドや化学化合物の投与を行い、そのスプライシング制御（異常スプライシングを正常パターンに戻す、またはエクソンスキッピングによりナンセンス変異などの重症型の変異をインフレーム変異へと置換する）による疾患軽症化を試みる。以上により、遺伝性腎疾患におけるスプライシング異常の関与の頻度を明らかとし、本研究により日本国内における遺伝性腎疾患における研究を飛躍的に向上させることを目的とする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度は以下の通り、研究を行い論文発表を行った。１）Alport症候群患者におけるsplicing異常が疑われる変異においてminigeneを作成し、実際にsplicing異常を来しているかの検証を行い、それらの変異の病原性の証明を行った（Horinouchi et al, Sci Rep, 2019）２）Pierson症候群で非典型的に軽症の臨床像を呈した患者において、RNAシークエンスによりイントロン内変異に伴うスプライシング異常を同定したが、同時に少量の正常のスプライシング産物も産生するため軽症化したという分子生物学的機序を証明した（Minamikawa et al, J Hum Genet, 2019）３）Dent病患者におけるCLCN5遺伝子のsplicing異常が疑われる変異においてminigeneを作成し、実際にsplicing異常を来しているかの検証を行い、それらの変異の病原性の証明を行った（Inoue et al, Clin Exp Nephrol, 2020）４）WT1遺伝子のスプライシング異常により発症するFrasier症候群において、アンチセンス治療薬を用いてスプライシングを制御することによる治療法の開発を行っている。４）Alport症候群のスプライシング異常例において、スプライシングを調節するU2蛋白に対するsiRNAによりスプライシング異常を起こさなくすることで治療ができる科の検討を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
私たちは、年間約５００件の遺伝子診断を行っており、膨大な次世代シークエンサーによる解析データをすでに保有しているが、これまでの遺伝子解析において、スプライシングに影響を与えることが明らかな変異（AG-GTのスプライシングコンセンサス配列）以外のイントロン内変異を有する場合や、アミノ酸の変化を伴わない一塩基置換（いわゆるサイレント変異）は、変異解析ソフトが病原性無しと判断するため見過ごされてきた。しかし、私たちはそのような変異でもスプライシング異常をきたすことにより病原性を有する場合が多々あることをアルポート症候群、Pierson症候群、Dent病など代表的遺伝性腎疾患において次々と明らかにしてきた。さらに対象疾患を増やし、網羅的にスプライシング異常の証明を行い、その疾患への関与について明らかにする予定である。
国内および海外においては、いかなる遺伝性腎疾患においてもそのスプライシング異常に着目し研究を行っている施設は存在しない。私たちは、アルポート症候群においては、その発症機序の解明を行い、世界に先駆けて治療法の開発を進めており、大変注目されている。そのため、本研究はすべての遺伝性腎疾患を対象とすることで、日本国内における遺伝性腎疾患治療研究を飛躍的に向上させることが可能である。
また、Alport症候群において開発を進めているアンチセンス治療薬による治療法を現在Frasier症候群に対して開発中である。具体的には患者由来尿中落下細胞から樹立した培養細胞の確立および、マウスモデルを作成し、その治療効果の判定を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
2019年度の研究において、次世代シークエンサーのランニングコストの低下があり、余剰金が発生した。2020年以降それに合わせ、解析件数をさらに増やし、スプライシング異常に関する研究をさらに進める。
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[Journal Article] Functional analysis of suspected splicing variants in CLCN5 gene in Dent disease 1.2020
Author(s)
Inoue T, Nagano C, Matsuo M, Yamamura T, Sakakibara N, Horinouchi T, Shibagaki Y, Ichikawa D, Aoto Y, Ishiko S, Ishimori S, Rossanti R, Iijima K, Nozu K.
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Journal Title
Clin Exp Nephrol
Volume: in press
Pages: in press
DOI
Peer Reviewed
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