2020 Fiscal Year Research-status Report

抗酸菌の防御における細胞性免疫応答の解析と新規ワクチン開発

Research Project

Project/Area Number	19K08939
Research Institution	Nihon University
Principal Investigator	相澤志保子日本大学, 医学部, 准教授 (30513858)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	舛廣善和日本大学, 生物資源科学部, 准教授 (00336083) 早川智日本大学, 医学部, 教授 (30238084) 権寧博日本大学, 医学部, 教授 (80339316)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	抗酸菌 / ワクチン / 非結核性抗酸菌 / 感染免疫 / 細胞性免疫
Outline of Annual Research Achievements	2020年度は以下の3つの研究を行なった。 1、rBCG-Mkan85BのNTM感染防御能の評価：2019年度にrBCG-Mkan85Bを接種したマウスとBCGを接種したマウス、対照群として、ワクチン非接種マウスのMycobacterium kansasiiに対する防御能を検討したが、BCGに対するrBCG-Mkan85Bの優位性は見られなかった。そこで、2020年度はrBCG-Mkan85Bをプライム接種し、M.kansasiiのantigen85Bを発現するDNAぺクター(DNA-Mkan85B)をDNAワクチンとして3回ブースト接種するプライムーブーストの系で検討を行なった。rBDG-Mkan85B/DNA-Mkan85B接種群、非接種群、BCG接種群のマウスにM.kansasiiを経気道感染させ、感染4~6週間後に解剖し、臓器内生菌数を調べた。肺内の生菌数は非接種群、BCG接種群に比較して、rBDG-Mkan85B/DNA-Mkan85B接種群で有意に低下した。BCG接種、rBCG-Mkan85B単独接種では抗原検査特異的CD4陽性ヘルパーT細胞を誘導可能であったが、CD8陽性細胞傷害性T細胞を誘導できなかった。一方、rBDG-Mkan85B/DNA-Mkan85B接種群では抗原検査特異的CD4陽性ヘルパーT細胞とCD8陽性細胞傷害性T細胞の両方を誘導することができた。上記の結果を論文にまとめ投稿準備中である。 2、ペプチドワクチン作成：目的とするペプチドを大腸菌で発現させる実験を行なった。 3、非結核性抗酸菌症（NTM症）における細胞性免疫応答の解析：NTM症患者の検体を施設内倫理委員会の承認のもと、書面で同意を得て採取し、末梢血単核球を分離し、in vitroで種々の抗原で刺激したのち、細胞内サイトカイン産生をフローサイトメトリーで解析した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 全体として、新型コロナウイルス感染症蔓延のため、実験施設への入構制限、動物実験の制限があり、予定通りの実験ができなかった。非結核性抗酸菌症（NTM症）における細胞性免疫応答の解析に関しては、2020年度は研究協力施設を増やして患者検体の採取ができるように試みた。しかし、臨床の現場では新型コロナウイルス感染症患者への対応のため、NTM症患者の検体採取が難しく、当初の予定よりも検体数が集まらなかった。ペプチドワクチン作成の実験では、昨年度に引き続き目的とするペプチドを大腸菌で発現させる系の構築を試みた。大腸菌のペリプラズムに移行させる系などを新たに試したが、発現がみられず、さらなる検討が必要である。 rBCG-Mkan85BのNTM感染防御能の評価の実験は概ね実験計画通りに進んでおり、現在論文を準備し2021年度中に投稿する予定である。
Strategy for Future Research Activity	ペプチドワクチン作成についてはタグの位置を変えるなど、プラスミドの構築、あるいは精製の方法を工夫して、膜透過性ペプチドの作成を目指す。膜透過性ペプチドが完成したら、まずはin virtoで細胞内への取り込みが見られるかどうか検討する。その後マウスを用いた動物実験を行う。 rBCG-Mkan85BのNTM感染防御能の評価の実験については、現在論文投稿準備中である。2021年度中に投稿する予定である。さらに、オスとメスのマウスを用いて感染実験を行い、感染感受性における性差の有無を観察する。コントロールとして、既存のBCGを用いる。 2021年4月現在も新型コロナウイルス感染症の蔓延状況は続いており、引き続きNTM患者検体採取には困難が伴うことが予想されるが、臨床医の協力をいただいて、多くの検体を採取できるように体勢を整える。
Causes of Carryover	2020年度は新型コロナウイルス感染症蔓延の影響を受け、当初予定していたよりも臨床検体が集まらなかったため実験に必要な抗体などを購入しなかった。加えて、世界的にチューブ、手袋、ピペットなどの実験消耗品の需要が増え、供給が不足し、年度末に購入予定だった物品が購入できなかった。また、ペプチド作成ができずin vitroの細胞の実験ができなかったため、次年度使用額が生じた。2021年度の予算と合わせて、抗体などの試薬、あるいはチューブ、手袋、ピペットなどの実験消耗品の購入に使用する。