2020 Fiscal Year Research-status Report

Mechanism of Donor MHC Specific Tolerance Induction and Maintenance

Research Project

Project/Area Number	19K09107
Research Institution	Toho University
Principal Investigator	辻昭一郎東邦大学, 医学部, 非常勤研究生 (70726736)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	桑原卓東邦大学, 医学部, 准教授 (40385563) 田中ゆり子東邦大学, 医学部, 講師 (40396685) 近藤元就東邦大学, 医学部, 教授 (20594344) 森田勇人城西大学, 理学部, 教授 (50274303) 羽賀博典京都大学, 医学研究科, 教授 (10252462) 上本伸二京都大学, 医学研究科, 教授 (40252449) [Withdrawn] 加藤悠太郎藤田医科大学, 医学部, 教授 (70265833) 犬飼美智子藤田医科大学, 医学部, 助手 (00839186)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2024-03-31
Keywords	免疫寛容 / 移植 / マウス / アデノ関連ウイルス / 制御性T細胞 / リンパ球キメラ / PD-1 / IDO産生細胞
Outline of Annual Research Achievements	マウスに抗原特異的免疫寛容を誘導するためには２種類の方法が報告されている。１つはレシピエントマウスの肝臓にグラフトのMHCを発現させる方法であり、もう一つはマウスの肝移植により自然免疫寛容を誘導する方法である。肝移植による免疫寛容導入はMHCの異なる移植肝が拒絶されないのみならず、引き続き移植肝と同じMHCのマウスから他の臓器を移植しても拒絶されない。本研究で免疫寛容の機構を究明するためにこれらの２つの方法を用いて免疫寛容を導入する方法の確立を行っている。まずドナーマウスの肝臓にグラフトのMHCを発現させるために、Adeno-Associated Virus (AAV)を用いることとし、ベクターを作成した。pAAV-CMVプラスミドのNruI/SpeIサイト間にGFPまたはMHC-１（H2-Kd）遺伝子断片をIn-fusionクローニング法により挿入した。GFPはpAcGFP-C1ベクターからAcGFP1をコードする領域をpAAV-CMVの該当領域に適合するように設計したプライマー配列を用いたPCR法で増幅したものを、MHC-1（H2-Kd）遺伝子は、NCBIのgeneデータベースに登録されている遺伝子配列をもとに作成した（Eurofin）合成DNAをそれぞれ用いた。なお、GFPを導入したプラスミドは、この後行うマウス肝臓での遺伝子発現を強化するためのプロモータ載せ替えの効果を可視化する目的で作成した。マウスの肝移植に関しては、Balb/cマウスの肝臓をC57BL/6に同所移植するための技術を確立した。ドナーから肝臓を愛護的に摘出した後、氷水中でグラフト肝の血管を生理食塩水を用いて灌流した。上大静脈は10-0ナイロンを用いて縫合し、門脈と下大静脈はカフにて接合した。胆管はビニールチューブを用いて接合した。本実験では肝動脈の接合は行わなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 新型コロナウイルスの蔓延に伴い緊急事態宣言が発令され、研究が制限されていた。また研究代表者が新型コロナウイルスの濃厚接触者となったため、研究が一時中断した。これらにより、研究の進行に遅延が生じている。
Strategy for Future Research Activity	まずマウス肝細胞での組み込み遺伝子（GFP/MHC-1）の発現を強化するために、ｐAAV-CMVベクターのCMVプロモータならびにβ-グロビンイントロン領域をそれぞれhuman alpha-1 anti-trypsin promoter (hAAT)ならびにApoE enhancer （ApoE）に置換することを目的とし、この両者がタンデムに接続されたhAAT-ApoE配列の合成（Eurofin）を既報の論文（Mol. Therapy 12 ; 85-101(2019)）をもとに現在進めている。 C57BL/6にAAVにて肝臓特異的にH2-Kdを発現させ、肝臓でのH2-Kdの発現量を比較検討する。またC57BL/6にBalb/cの肝臓を同所移植した時の、肝臓でのH2-Kdの発現量の経時的変化を測定する。H2-Kdの発現量と免疫寛容の強さや導入までの時間などとの相関を検討する。外来MHCの肝臓への導入により肝障害が誘導されるかを検討するために、MHCの異なる同所肝移植を行うと肝臓が拒絶されるPD-L1ノックアウトマウス（C57BL/6バックグラウンド）にH2-Kdを肝臓特異的に発現させ、肝障害誘導の有無を検討する。更にC57BL/6に肝臓特異的にH2-Kdを発現させた後、C57BL/6マウスの肝臓を同所移植することにより、肝臓にH2-Kdの発現がなくても、H2-Kdに対する免疫寛容が維持されるかどうかを確認する。免疫寛容維持における制御性T細胞（Treg）、PD-1/PD-L1シグナル、IDO産生細胞の役割を解明するために、免疫寛容導入後に抗CD25抗体でTregを除去しても免疫寛容が維持されるか、また抗PD-L1抗体あるいは1-methyl-tryptophanでPD-1/PD-L1シグナルやIDO産生細胞の働きを阻害しても免疫寛容が維持されるかを確認する。
Causes of Carryover	新型コロナウイルスの影響により、研究の進行にやや遅れが生じており、そのため未使用分が発生した。2021年度は2020年度からの次年度使用分および当初よりの使用予定分の双方を使用し、ノックインマウスの作成、MHCの遺伝子導入実験、遺伝子改変マウスを用いた肝移植実験、放射線感受性実験、リンパ球キメラ実験、臨床症例との比較検討を行う予定である。