Mechanism of Donor MHC Specific Tolerance Induction and Maintenance

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09107
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 辻 昭一郎 東邦大学, 医学部, 非常勤研究生 (70726736)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 桑原 卓 東邦大学, 医学部, 准教授 (40385563) ; 田中 ゆり子 東邦大学, 医学部, 講師 (40396685) ; 近藤 元就 東邦大学, 医学部, 教授 (20594344) ; 森田 勇人 城西大学, 理学部, 教授 (50274303) ; 羽賀 博典 京都大学, 医学研究科, 教授 (10252462) ; 上本 伸二 京都大学, 医学研究科, 教授 (40252449) [Withdrawn] ; 加藤 悠太郎 藤田医科大学, 医学部, 教授 (70265833) ; 犬飼 美智子 藤田医科大学, 医学部, 助手 (00839186)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 免疫寛容 / 移植 / マウス / アデノ関連ウイルス / 制御性T細胞 / リンパ球キメラ / PD-1 / IDO産生細胞

Outline of Annual Research Achievements

2023年度は、2022年度に感染させた、GFPによる蛍光を指標としたAAVベクターの発現効率を確認する系について、感染条件の最適化を、１）感染経路の選択（腹腔内投与、尾静脈）、２）ウィルス作成に用いるHEK293T細胞の至適化（研究室で継代している株、TAKARA BI株）、さらに３）ウィルス作成用トランスフェクション試薬の選択（TransIT-293,　TransIT VirusGEN）の条件で検討し、AAVベクターを介した肝臓での遺伝子発現の効率の最適化を試みた。
その結果１）については、肝臓での発現効率は尾静脈を経由して投与した方が選択的感染効率が高いこと、２）TAKARA推奨株を指定条件下で培養したHEK-293Tの方が、これまで使用してきた研究室での継代株よりもウィルス作成効率が50%程度高いこと、３）TranIT-293を用いてトランスフェクションを行うほうが、TransIT VirusGENを用いるより、ウィルス作成効率が高いことを確認した。また、トランスフェクションに用いるプラスミドは、市販の精製キットを用いるだけでなく、その後にCsClによる超遠心分離精製を行うことで、ウィルス作成効率が高まることを確認し、T225フラスコ1本あたり安定して1×10^11vg以上のAAVを作出することに成功した。
Balb/cマウスの肝臓をC57BL/6マウスに同所移植を行い、ALTを指標に肝障害の程度を評価し、評価するタイムポイントを設定した。移植成功例においてはUW液の有無による違いはなかったが、UW液未使用の場合は肝障害が高度で実験の継続が困難になるマウスの割合が増加するため、UW液は使用することで条件を統一した。また移植条件を同じくする目的で再還流までの時間も統一し、実験系の最適化を行った。その上でマウスの同所肝移植による免疫寛容の成立因子を免疫染織にて検討した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

2023年度は比較的順調に研究が進展したが、2019年から新型コロナウイルス感染症が5類感染症に変更される2023年5月8日までの間、新型コロナウイルス感染症が流行するたび、あるいは勤務先の病院で発症するたびに実験が停止した影響で、全体としての研究の進行は遅れている。

Strategy for Future Research Activity

2023年度の成果を用いて、H2-Kdの肝臓での発現を行ったマウスを2024年度に作成し、H2-Kdの発現効率の評価を行う。また遺伝子レベル、タンパク質レベルでの発現の確認を行い、免疫寛容の生理学的解析を行う予定である。
2024年度はPD-1ノックアウトマウスと抗PD-1抗体を用いて、AAV遺伝子導入モデルと肝移植モデルにおいてPD-1シグナルの免疫寛容の成立と維持における働きを解明していく。また経時的なTregの発現状況やアポトーシスの誘導との関係からTregの免疫寛容の成立のおける役割を解明する。AAVによる遺伝子導入後と肝移植後におけるリンパ球キメラの割合やその性質を比較することにより、免疫寛容におけるリンパ球キメラの状態を評価していく。さらにC56BL/6マウスのMHCであるH2-KbをH2-Kdに置換したC56BL/6-Kdマウスの作成を行う予定である。

Causes of Carryover

2023年5月8日に新型コロナウイルスが5類感染症に変更されるまでに、研究者たちが新型コロナ感染症に罹患したり、実験施設への入室制限などがあり、予定の研究が進行せず、未使用分が発生した。5類に変更後は比較的実験の制限が緩和されたが、完全に平時にはもどっていない。しかし研究の進展はかなり改善し、動物実験やコンストラクトの作成などで著しい進展がみられ、今後の研究の進捗が期待される。遺伝子改変動物の作成と平行して、マウス肝移植モデルを用いて、免疫寛容を成立させる因子を、免疫染織、ELISA、FACS等にて見つけていく。また遺伝子改変動物を用いた肝移植実験にて、免疫寛容成立の必要因子を同定していく予定であり、未使用分はこれらの実験に使用する予定である。