2019 Fiscal Year Research-status Report

血小板と白血球の相互作用による敗血症増悪病態におけるmicroRNAの役割の解明

Research Project

Project/Area Number	19K09427
Research Institution	Kansai Medical University
Principal Investigator	影山京子関西医科大学, 医学部, 研究医員 (80347468)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中嶋康文関西医科大学, 医学部, 教授 (70326239)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	遺伝子治療 / 敗血症
Outline of Annual Research Achievements	敗血症時の血小板と好中球の相互作用において、血小板由来miRNAの役割を、ヒト正常血小板、好中球を用いた共培養実験系（In Vitro系）を施行した。健康成人被験者から、1回20ｍｌの採血を行う。クエン酸採血後、遠心操作にて洗浄血小板溶液作成、及びHistopaque等を用いて好中球の分離を行った。（好中球との共培養実験）蛍光倒立顕微鏡での観察下に、フローチャンバーシステムを用いた好中球と、血小板の共培養系において、LPS、ヒストン、HMGB-1等を含有する（コントロール群は含有しない）培養液で負荷した血小板を、好中球が生着した培養器に還流し、好中球の脱顆粒化、NETs、ヒストンを蛍光色素染色後、半定量化し検討した。（miRNAの分離と濃縮）血小板、好中球、及び還流液検体から、mirVanaTM miRNA Isolation Kit 等を用いてmiRNAを抽出した。１）包括的miRNAの発現プロファイリング　定量性のある網羅的miRNAプロファイリングを、従来のマイクロアレイ法よりも、優れた次世代高速シーケンサーIon PGMシステム（Life Technology社)を用いる。２）Small RNAのライブラリ作成　Ion Total RNA-Seq Kitを用いる　３）cDNAに変換、増幅。逆転写後、エマルジョンPCR法で、cDNAを増幅　４）シーケンシング（３時間）シーケンサーによるmiRNA発現定量　５）データ解析（１時間）サーバーにSFFまたはFASTQ形式データの転送。統計学的な有意差検定を伴う発現定量解析には、CLCバイオ社の解析ソフト（Genomic Work Bench）を使用した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本年度中に、特定miRNAの検出と定量において、Real-Time PCR法でのmiRNA発現の絶対定量、ウエスタンブロッティングによるmiRNAの標的となるタンパク質の半定量を施行する予定であったが、次年度に繰り越しになったため、来年度に施行予定である。
Strategy for Future Research Activity	上記の実験で特に還流液中で上昇した（血小板由来と考えられる）miRNAのmimic（Pre-miRTM miRNA Precursor Molecules, Ambion社）と、そのmiRNAに特異的なmiRNA阻害薬（Anti-miRTM miRNA Inhibitor, Ambion社）を、好中球へ遺伝子導入し、好中球の脱顆粒化、NETs、ヒストンを蛍光色素染色後、半定量化し比較検討する予定である。また、敗血症患者を対象とした臨床研究において、上記の実験結果が再現できるかも検討予定にしている。
Causes of Carryover	本年度の培養細胞実験で、特に還流液中で血小板由来と考えられる複数のmiRNAが上昇したそのmiRNAが、好中球に及ぼす機能を調べるため、対象となるmiRNAに特異的なmimic（Pre-miRTM miRNA Precursor Molecules, Ambion社）と、miRNA阻害薬（Anti-miRTM miRNA Inhibitor, Ambion社）を、好中球へ遺伝子導入し、好中球の脱顆粒化、NETs、ヒストンを蛍光色素染色後、半定量化し比較検討する予定である。また、敗血症患者を対象とした臨床研究において、上記の実験結果が再現できるかも検討予定にしている。