2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K09681
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| Research Institution | Hyogo Medical University |
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Principal Investigator |
後藤 章暢 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (70283885)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松永 渉 兵庫医科大学, 医学部, 助教 (20415300)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | アデノウイルスベクター / CRISPR-Cas9 / 血管新生阻害療法 / 膀胱癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膀胱癌の7割程度を占める筋層非浸潤癌は、再発を繰り返し悪化する難治性の癌である。現在、BCGや抗癌剤の膀胱内注入が標準的治療であるが、患者の半数が治療中止を余儀なくされるほどの副作用があるため、効果的で副作用の低い治療法開発には大きな意義がある。当研究室は難治性膀胱癌治療を目的として、癌細胞に特異的に感染増殖するアデノウイルスベクターAd5F35/MKp-E1を開発した。このベクターは、腫瘍溶解性ウイルスとして膀胱癌に強い抗腫瘍作用を示したが、臨床応用を考えると治療効果に懸念を残していた。そこでこのAd5F35ベクターに血管内皮増殖因子を標的とするCRISPR-Cas9を組み込み、治療能力を向上させた。血管新生阻害療法は、腫瘍組織の血管形成を阻害し、癌細胞を枯死させる治療法であるが、既存の方法には腫瘍への特異性が無いため、しばしば正常な血管新生を阻害して重篤な副作用を起こす。しかし、Ad5F35の癌細胞への特異性を利用し血管新生を阻害すればAd5F35に懸念される治療効果の弱点を補完し、癌に特異的で安全な血管新生阻害療法を実現できると考え、CRISPR-Cas9を組み込んだAd5F35ベクター作製のためのプラスミド構築を行った。当初の計画では、同じAd5F35ベクター中にCas9エンドヌクレアーゼとガイドRNA配列を組み込むとしていたが、Ad5F35にはCas9エンドヌクレアーゼ遺伝子のみを搭載し、ガイドRNAには市販のアデノ随伴ウイルスベクターを用いることにした。これによりガイドRNAの変更が簡単になり、応用範囲も容易に広げられるようになる。また、当初計画ではAd5F35の増殖能力はそのままにする予定であったが、増殖による腫瘍溶解で遺伝子が発現する前に癌が崩壊するため効果が観察しにくいと考え、先ずは増殖能力を削除したAd5F35でCas9遺伝子の送達の可能性を検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本年度はCRISPR-Cas9を搭載したAd5F35アデノウイルスベクターの作製を目標としていた。
本実験は遺伝子組換え実験であるため、実施に当たっては本学設置の委員会へ計画を提出し、承認を得る必要がある。計画書の審査のための時間や、ヒト化Cas9プラスミドの輸入に際した本学の事務手続きにも合わせて数カ月の時間を要した。
また、上述したように当初考えていたベクターの設計を変更したことに加えて、外注予定であった作業を当研究室で行う事となり、ここでプラスミドの発現の低さや、平滑末端同士のライゲーションで効率がかなり低い等の困難があり、進捗が遅れている。現在、Cas9搭載Ad5F35ベクターの製作は三分の二程度の進捗となっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
実際の製作は難航しているものの、CRISPR-Cas9システム搭載Ad5F35ベクターの設計は確定し、また材料となる各種プラスミドもそろっている。このため、実際のAd5F35プラスミド構築を外注することで、製作を早める。そして、Ad5F35ベクターによる培養細胞でのCas9遺伝子発現を確認の上で、市販のAAVベクターシステム（タカラバイオ、AAVpro® CRISPR/Cas9 Helper Free System等）を利用した、血管内皮増殖因子(VEGF)を標的とするガイドRNAを用いて、in vitroで血管誘導因子の阻害効果を検討する。
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| Causes of Carryover |
CRISPR-Cas9遺伝子を搭載したAd5F35ベクターを開発することが、目下の最重要課題である。外注予定であった作業を当研究室で行ったことに加えて、研究が計画よりも遅れたため残額が生じたが、次年度にはAd5F35ベクターのプラスミド構築作業を外注することにする。また、プラスミドが完成した後も、Ad5F35ベクターの製造と高力価のベクター回収に困難が予想されるので、その実験にも使用する予定である。
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