2020 Fiscal Year Research-status Report
がんサバイバーの生殖補助医療におけるMRTの応用を目指した研究
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19K09772
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
立花 眞仁 東北大学, 大学病院, 准教授 (30431571)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
志賀 尚美 東北大学, 大学病院, 助教 (20595558)
渡邉 善 東北大学, 大学病院, 助教 (40722567)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | がん生殖 / 卵子凍結 / ミトコンドリア / 核移植 / 細胞質移植 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、昨年度の続きで新鮮卵によるPBT、MSTの検証を行った。昨年度にPB2Tの検討からは効率的にPB2Tにて雌性前核を選択して単離することが困難であることがわかり、治療法として成立可能な兄弟胚の安定獲得が困難であることが明らかとなった。そこで、PB1Tによる第一極体のレスキューとMII期紡錘体置換の組み合わせに焦点を絞って行うこととした。なお、この場合最大で一個の卵子から２個迄の兄弟胚作成が可能となる。新鮮卵PB1Tにおいてはピペット径やタイミングの工夫により３６％～最大８８％の高率で再構築卵を得ることが可能で、その後のICSIによる受精率は６７％～８６％、胚盤胞率は５０～７５％と許容できる範疇であった。また、紡錘体置換は再構築成功率１００％、受精率７５％、胚盤胞率１００％と安定していた。次に凍結融解卵による検証に入ったが、マウス未受精卵を一般的に確立されたガラス化法を用いて凍結融解を行ったところ、第一極体の崩壊がほぼ１００％であり、既知の種々の方法で結果は変わらなかった。つまり、第一極体は細胞膜や核が不安定で凍結融解に向かないことが明らかとなった。一方、MII紡錘体を置換するMST法においては、MII紡錘体の凍結融解を行っても新鮮な細胞質の移植を行えば胚発育、胎児発育においても全く問題が無いことが既に高等霊長類で確認されている。そこで凍結法の改善、または抜本的な解決策が必要と考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
予想以上に極体の自然崩壊と顕微操作による破裂が深刻であり、カスタムピペットのオーダーや採卵後の顕微操作までの至適時間の検証など試行錯誤に時間を要した。マウス凍結融解卵の第一極体の崩壊の抑制については、凍結法の改良による解決策を見出せなかったが、後述の全く新しい発想によりブレイクスルーとなる技術に発展する可能性がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度の結果を受けて、現在全く新しい発想での第一極体のレスキュー方法の開発を開始している。従来の発想を逆転させ、凍結を行う前に自己の細胞質からMII紡錘体を単離し、そのまま第一極体を自己のMII細胞質へPB1Tするautologous PB1T（aPB1T）を行って凍結を行うことにより、移植された第一極体が新たなMII紡錘体を形成した状態で凍結することにより崩壊を回避可能ではないかと考えた。また、単離した紡錘体はそのまま凍結融解を行うか、先にドナー細胞質へMSTを行って再構築した卵子を凍結するかのいずれかが問題解決につながると考えて予備実験を開始。まだaPB1Tの融合率は従来のheterologous PB1T(hPB1T)に劣っているが、操作ステップが減るため第一極体の顕微操作による崩壊率は格段に減少している。癒合したものの胚発生は上記通常のPB1Tと同等であることを確認している。ここまでは新鮮卵で手技の検証を行っているが、今後は凍結融解を行って、兄弟胚作成効率、胚発生率で通常の未受精卵凍結に対する優位性を検証する。そのうえで当初予定していた胚移植による産仔獲得、分子生物学的検討を加えて検討する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額は今年度の研究を効率的に推進したことに伴い発生した未使用額である。令和3年度請求額と合わせて使用する。引き続き実験動物購入は必要である。その他、実験消耗品、分子生物学的検討に用いる試薬の購入を予定している。最後に論文にまとめた際の英文校正、投稿費用にも使用予定である。
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Research Products
(2 results)
