2020 Fiscal Year Research-status Report

新規粘膜アジュバントを用いた広域スペクトラムワクチンの開発に関する研究

Research Project

Project/Area Number	19K09850
Research Institution	Kagoshima University
Principal Investigator	黒野祐一鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 客員研究員 (80153427)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	宮下圭一鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 助教 (30585063) 川畠雅樹鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 助教 (30585112) 永野広海鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 講師 (60613148) 大堀純一郎鹿児島大学, 医歯学域医学系, 准教授 (90507162)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	結合型ホスホリルコリン重合体 / 経鼻免疫 / アジュバント作用 / 細菌接着性
Outline of Annual Research Achievements	結合型ホスホリルコリン（PC）重合体（Reactive MPC：R-MPC）のアジュバント効果を確認するため、本年度は、卵白アルブミン（OVA）とR-MPC（R-MP群）あるいは非結合型PC（MPC）（MPC群）とともにマウスに経鼻投与し、その免疫応答を観察したところ、OVA特異的抗体価はR-MPC群のほうがMPC群より若干高値であった。しかし、PC特異的抗体価はMPC群のほうがR-MPC群よりも高値であり、R-MPCの粘膜アジュバントとしての優位性を示すことができなかった。その理由として、分子量およびPCの含有量がMPCとR-MPCとで大きく異なることが推測された。そこで、MPCの代わりに結合性をなくしたR-MPCで検討する必要があり、その方法を模索したところ、R-MPCをグリシンで処理することでその結合性が消失することが分かった。そこで、R-MPC+OVA群（A群）、R-MPC+グリシン+OVA群（B群）、R-MPC単独群（C群）、R-MPC+グリシン（D群）で経鼻免疫応答を観察した結果、まだサンプル数がすくないため有意差はないが、OVA特異的抗体価そしてPC特異的抗体価はともにA群がもっとも高い傾向があり、R-MPCにアジュバント作用があること、さらにそのアジュバント作用はR-MPCが抗原と結合することで得られると考えられた。また、今回、粘膜接着性を高めたPC重合体製剤を新たに開発し、その直接的な感染予防効果を評価するため、in vitroで肺炎球菌およびインフルエンザ菌のヒト咽頭粘膜上皮細胞株（Detroit 562）への接着抑制作用を検討した。その結果、濃度依存性の抑制効果がみられ、0.05%の濃度でも対照群（生理食塩水）と比較して有意に肺炎球菌およびインフルエンザ菌の接着が抑制された。これらの結果から、PC重合体はワクチン抗原のみならずアジュバントとして免疫応答を誘導するのみならず、その直接作用によっても細菌感染を抑制できることが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初はR-MPCにPC-KLHを結合させてPC特異的免疫応答の増強効果を観察する予定であったが、R-MPCのみでもOVAと結合させることで高いPC特異的免疫応用が得られたので、PC-KLHを結合させる必要はないと考えた。しかし、非結合型のMPCでも、OVAとともに経鼻投与することでOVAおよびPCに対する免疫応答が亢進したため、R-MPCと抗原の結合がそのアジュバント作用を誘導するのに必須であることに疑問が生じた。そこで、R-MPCをPspAやP6と結合させてその免疫応答を観察するまえに、結合化の必要性を証明することが必要と考え、R-MPCの結合性をなくす方法について、このPC重合体を供与してもらっている日油（株）と検討を重ね、R-MPCをグリシンで処理することで、その結合性が消失することが判明した。そして、R-MPC+OVA群（A群）、R-MPC+グリシン+OVA群（B群）、R-MPC単独群（C群）、R-MPC+グリシン（D群）でOVAおよびPCに対する免疫応答を比較したところ、R-MPCにアジュバント作用があり、それが抗原と結合してはじめて得られることが示唆され、本研究を計画した際の仮説の正当性が証明された。また、当初は計画していなかったが、粘膜接着性が高いPC重合体が新たに開発されたため、PC重合体の直接的感染予防効果があるかもしれないと考え、in vitroでその肺炎球菌およびインフルエンザ菌の細胞接着抑制効果を検討した。なお、この方法はこれまでに報告がなく、我々が独自に開発したものである。その結果、予想通りの結果が得られ、PC重合体がアジュバントとしての広域スペクトラム粘膜ワクチンに応用できるだけでなく、その直接作用によっても感染予防ができると推測された。
Strategy for Future Research Activity	R-MPCのアジュバント作用についてはOVAを抗原とした同様の実験を繰り返し行い、統計学的な有意差検定ができるまでサンプル数を増やし、その効果を確認する。また、血清、唾液、鼻腔洗浄液中のOVAおよびPC特異的抗体活性のみでなく、Th1ならびにTh2型の免疫応答、さらにIgE産生の有無を観察する。これらの実験でR-MPCの粘膜アジュバント作用と安全性が実証されたなら、R-MPCのPspAおよびP6との結合性を確認し、これをOVAと同様にマウスに経鼻投与し、PspAならびにP6、そしてPC特異的免疫応答を確認する。もし、これらすべての経鼻投与で有意な免疫応答が認められたら、PspAとP6をともにR-MPCと結合させ、肺炎球菌およびインフルエンザ菌に対してより効果が強くさらに広域スペクトラムを有する粘膜ワクチン開発の可能性についても検討することを計画している。また、R-MPCの投与によるIgE産生の抑制が確認されたなら、アレルギー性鼻炎モデルマウスを作成して、アレルギー性炎症に対する効果も観察することを計画している。粘膜接着性が高いPC重合体製剤に関しては、その臨床応用として、新たな含嗽薬としての有効性を検討する予定である。この接着抑制作用は細菌のみならずウイルスに対しても働くと考えられ、このPC重合体製剤が細菌感染症のみならず感冒やインフルエンザさらには新型コロナウイルス感染の予防にも有効な含嗽薬として応用できるかもしれない。
Causes of Carryover	R-MPCのアジュバント作用誘導にはR-MPCと抗原蛋白との結合が必須であることが、本年度の実験でようやく証明できた。そこで、次年度は、R-MPC粘膜アジュバントの臨床応用を目的として、PspAやP6との結合性を確認し、さらにその経鼻投与による免疫応答を観察することを計画している。しかし、PspAやP6の作成がいまだ遅れており、次年度内に供与を受けられないことも想定される。したがって、その場合は現在臨床に用いられている結合型肺炎球菌ワクチンとR-PMCとの結合性、そしてその粘膜免疫応答を観察する予定である。また、これらのワクチンによる感染予防効果を証明するには鼻咽腔からの細菌クリアランスを確認する必要があるが、当大学の動物実験施設の改装に伴い感染実験が困難な状況にある。そこで、経鼻免疫後に採取されたサンプルによる細菌の接着抑制作用や殺菌作用を in vitroで観察することを計画している。粘膜接着性が高いPC重合体製剤については、その臨床応用への可能性を明らかにするため、本製剤を含嗽薬として使用した際の粘膜上皮への接着抑制効果を検討することを計画している。本研究で用いる口腔粘膜上皮への接着細菌数の測定方法についてはすでに確立しており、実施が可能な状況にある。