網羅的発現解析が明らかにした眼特異的転写産物は角膜再生の新規キープレーヤーか？

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K09993
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 木下 晃 長崎大学, 原爆後障害医療研究所, 講師 (60372778)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小路 武彦 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (30170179)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: ITPR1 / Gillespie syndrome / 無虹彩症 / 神経堤細胞 / 角膜

Outline of Annual Research Achievements

遺伝性疾患Gillespie syndrome（GLSP）は運動失調と無虹彩症を特徴とする稀な遺伝性疾患である．報告者は次世代型シーケンサー（NGS）を用いた変異解析の結果，本邦のGLSP患者5名に，inositol 1,4,5-triphosphate receptor type 1（ITPR1）遺伝子の3’-末端側に変異ホットスポットを同定した．ITPR1はカルシウムチャンネルとして働く巨大タンパク質（2743アミノ酸残基）であり，小脳性運動失調の責任遺伝子として知られているが，何故GLSP患者が無虹彩症を併発するのかは不明である．
この謎を解明するために以下の実験を行った．変異ホットスポットはタンパク質のC-端側にあるため，未知の転写開始点があると仮定し，マウス眼RNAを材料にRNA-seqを行った．この結果，報告者は新規転写開始点を同定し，この転写産物は218アミノ酸残基からなることを明らかにした（以下218フォームと呼ぶ）．加えてこれまでに作製されたたItpr1ノックアウト（KO）マウスと異なり，新規に作製したKOマウスは運動失調に加えて神経堤細胞に由来する前眼部組織（角膜内皮など）が消失した無虹彩症の表現系を示した．
これらの結果から218フォームが神経堤細胞から前眼部組織の分化に関わるキープレーヤーであると考えた．眼特異的な218フォームの発現調節機構，神経堤細胞由来の前眼部組織（特に角膜）の形成過程における経時的な発現の変化，218フォームに結合するタンパク質の同定に基づく未知の機能の予測・解明という3つの研究を柱に，218フォームによる頭部神経堤細胞から角膜形成過程の分子メカニズムを明らかにし，角膜再生医療の基礎研究とする．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

令和元年度は，まず218フォームが眼発生特異的にタンパク質として存在するかを確認した．Itpr1のC-末端側を認識する市販抗体は特異性が低いためItpr1の3’-末端にV5タグ配列をノックインした遺伝子改変マウスを作製した．マウスはヒトと異なり，生後２週間程度で眼の組織が完成する．このため胎生14日から生後3週までの期間に眼と脳からタンパク質を抽出しウエスタンブロッティングで発現を確認した．眼の発生が進む胎生16日から生後3週まで218フォームの予想分子量と一致する25kDaのタンパク質の発現量が眼特異的に増加した．また脳以外の器官（皮膚，心臓，など）でも発現は確認できなかった．
次に新規転写開始点の周辺配列をクローニングし，レポーターアッセイを行った．周辺配列を挿入したNanoLucベクターは単独でも強い転写活性を持っていた．この周辺配列中には眼の発生の鍵となるPAX6の結合配列が存在することを公共データベースで確認した後，新規転写産物の転写を制御する転写因子の探索を行った．PAX6をはじめとする計10種類の転写因子を発現するベクターとコトランスフェクションしたところ，c-MAFのみが転写活性を著しく上昇させた．in silico解析から新規転写開始点の近傍にc-MAF結合配列が存在することを確認し，クロマチン免疫沈降法によりc-MAFが結合することを確認した．
また前述のPAX6結合配列は神経堤細胞のマーカーであるSox9の結合配列とオーバーラップしており，SOX9はc-MAFの転写活性を抑制した．眼の発生が進むにつれて218フォーム発現量は増加するが，SOX9の発現量は反比例して消失していく．おそらくSOX9からc-MAFへの切り替えが218フォームの発現を決定していると考えている．

Strategy for Future Research Activity

来年度は218フォームの機能解析を行い，「どのような機序で，神経堤細胞から前眼部組織へと分化させるのか？」の解明を目指す．ITPR1は2743アミノ酸残基からなるカルシウムチャンネルであるが，わずか218アミノ酸残基のアイソフォームは未知の機能を持つと予想される．
機能解析の第一歩として「218フォームの未知の機能」を結合するタンパク質から予測する．前述の3’-末端にV5タグ配列をノックインしたマウス眼からタンパク質を抽出して，anti-V5抗体を用いて共免疫沈降するタンパク質を回収し質量分析を行い，結合するタンパク質を同定する．複数の結合タンパク質が同定できれば分化機構のパスウェイが予測可能である．また野生型218フォームとGLSP患者で同定された変異を導入した218フォームを用いて培養細胞にトランスフェクションし，結合能に差があるかを検討する．
また，前眼部組織が消失したItpr1 KOマウスと野生型のマウスの眼からRNAを抽出しRNA-seqを行う.胎生14日（218フォームの発現なし）,胎生18日および生後0日（218フォーム発現弱)，生後2週（218フォームの発現強）のタイミングで組織の摘出を行う．神経堤細胞から前眼部組織へと分化する過程での遺伝子発現の変動を比較して，この分化に関わるパスウェイを解明する．
加えて眼組織における218フォームの局在を明らかにするために、V5ノックインマウスを用いた免疫染色を行う．

Causes of Carryover

本年度行ったレポーターアッセイや免疫沈降法などに必要な試薬類はすでに所有していたために、経費を必要としなかった．また所属学会の年会は長崎市内で開催されたため出張旅費は必要なかった．
令和2年度は度はRNA-seqなど高額な試薬を使う実験を予定しており、未使用分を含めて予算を執行する．

Research Products

• [Journal Article] Target Capture/Next-Generation Sequencing for Nonsyndromic Cleft Lip and Palate in the Japanese Population. (2020)
  • Author(s): Shibano M, Watanabe A, Takano N, Mishima H, Kinoshita A, Yoshiura KI, Shibahara T
  • Journal Title: The Cleft palate-craniofacial journal Volume: 57 Pages: 80-87
  • DOI: 10.1177/1055665619857650
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genome analysis of myelodysplastic syndromes among atomic bomb survivors in Nagasaki. (2020)
  • Author(s): Taguchi M, Mishima H, Shiozawa Y, Hayashida C, Kinoshita A, Nannya Y, Makishima H, Horai M, Matsuo M, Sato S, Itonaga H, Kato T, Taniguchi H, Imanishi D, Imaizumi Y, Hata T, Takenaka M, Moriuchi Y, Shiraishi Y, Miyano S, Ogawa S, Yoshiura KI, Miyazaki Y
  • Journal Title: Haematologica Volume: 105 Pages: 358-365
  • DOI: 10.3324/haematol.2019.219386.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Immunofluorescence analysis of DNA damage response protein p53-binding protein 1 in a case of uterine dedifferentiated leiomyosarcoma arising from leiomyoma. (2019)
  • Author(s): Matsuda K, Akazawa Y, Yamaguchi Y, Mussazhanova Z, Kurohama H, Ueki N, Kohno M, Fukushima A, Kajimura I, Hiraki H, Matsuwaki T, Kawashita S, Kinoshita A, Nakashima M
  • Journal Title: Pathology, research and practice Volume: 215 Pages: 152640
  • DOI: 10.1016/j.prp.2019.152640
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Nonsense mutation in CFAP43 causes normal-pressure hydrocephalus with ciliary abnormalities. (2019)
  • Author(s): Morimoto Y, Yoshida S, Kinoshita A, Satoh C, Mishima H, Yamaguchi N, Matsuda K, Sakaguchi M, Tanaka T, Komohara Y, Imamura A, Ozawa H, Nakashima M, Kurotaki N, Kishino T, Yoshiura KI, Ono S.
  • Journal Title: Neurology Volume: 92 Pages: e2364-e2374
  • DOI: 10.1212/WNL.0000000000007505
  • Peer Reviewed / Open Access