2019 Fiscal Year Research-status Report
象牙芽細胞とエナメル芽細胞を蛍光標識できるマウスの歯の前駆細胞を用いた歯の形成
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19K10041
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
山崎 英俊 三重大学, 医学系研究科, 教授 (00283987)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
磯野 加奈 三重大学, 医学系研究科, 技術補佐員 (10833858)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 象牙芽細胞 / エナメル芽細胞 / Dspp / Amelx / 象牙芽細胞前駆細胞 / エナメル芽細胞前駆細胞 / tdTomato / GFP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
初年度は、１）蛍光を指標にしたエナメル芽・象牙芽細胞の同定と単離・遺伝子解析を計画した。まず、我々が作製した象牙芽細胞特異的遺伝子Dsppとエナメル芽細胞特異的遺伝子Amelxの発現をGFPあるいはtdTomatoで検出できるマウスの象牙芽細胞及びエナメル芽細胞を蛍光を指標に同定・単離した。その際、細胞表面分子に対する抗体や抗DSP抗体、抗AMELX抗体を用いて蛍光とエナメル芽細胞、象牙芽細胞、エナメル質、象牙質の関係を組織学的に検討した。その結果、象牙芽細胞がGFPを、エナメル芽細胞がtdTomatoを発現していることが確認できた。次に、エナメル芽細胞や象牙芽細胞のフローサイトメトリーでの同定・単離を目的として、上皮細胞及び間葉系細胞マーカーを用いて検出を試みた。GFP陽性の象牙芽細胞は、間葉系細胞マーカー陽性/上皮細胞マーカー陰性の細胞集団に、tdTomato陽性のエナメル芽細胞は、上皮細胞マーカー陽性/間葉系細胞マーカー陰性の細胞分画に濃縮されることを確認した。さらに、象牙芽細胞とエナメル芽細胞を同時に別蛍光で標識できるマウスの歯を用いて、GFP陽性細胞とtdTomato陽性細胞を同定・単離できることを組織学的及びフローサイトメトリー法を用いて明らかにした。２）細胞表面マーカーと蛍光を指標にしたエナメル芽・象牙芽前駆（幹）細胞の同定と単離（歯の器官形成を含む）を計画した。細胞表面分子に対する抗体を用いて歯胚のエナメル器・歯乳頭に特異的に発現する分子を調べた。細胞表面分子に対する抗体を用いてGFP陰性で器官培養後、GFP陽性になる象牙芽細胞前駆細胞或はtdTomato陰性で器官培養後にtdTomato陽性になるエナメル芽細胞前駆細胞を歯胚培養を用いて蛍光を指標に単離・同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度は、１）蛍光を指標にしたエナメル芽・象牙芽細胞の同定と単離・遺伝子解析を計画し、我々が作製した象牙芽細胞特異的遺伝子Dsppとエナメル芽細胞特異的遺伝子Amelxの発現をGFPあるいはtdTomatoで検出できるマウスの象牙芽細胞及びエナメル芽細胞を蛍光を指標に組織学的およびフローサイトメトリー法を用いて同定・単離した。遺伝子解析として、歯上皮と口腔上皮に発現する遺伝子の違いを調べる目的で、胎仔の凍結切片から組織を切り出し、RNAを回収し、シークエンス解析を計画したが、機器の故障により回収したRNAの量が足らず、シークエンス解析を来年度に廻した。
２）細胞表面マーカーと蛍光を指標にしたエナメル芽・象牙芽前駆（幹）細胞の同定と単離（歯の器官形成を含む）を計画し、細胞表面分子に対する抗体を用いて歯胚のエナメル器・歯乳頭に特異的に発現する分子を調べた。細胞表面分子に対する抗体を用いてGFP陰性で器官培養後、GFP陽性になる象牙芽細胞前駆細胞或はtdTomato陰性で器官培養後にtdTomato陽性になるエナメル芽細胞前駆細胞を歯胚培養を用いて蛍光を指標に単離・同定した。
以上より、遺伝子解析は来年度に回したが、概ね研究計画通りに進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）蛍光を指標にした機能的なエナメル芽・象牙芽前駆細胞の同定と単離（歯の器官形成を含む）を目指す。象牙芽細胞をGFPでエナメル芽細胞をtdTomatoで蛍光標識できるマウスを用いて、培養前は蛍光陰性で培養後に蛍光陽性になる象牙芽細胞前駆(幹)細胞或はエナメル芽細胞前駆(幹)細胞を単離したので、本年はさらに、これらの前駆細胞がDSPP,AMELXを産生できる機能的な前駆細胞であるかを確認する。
２）歯の分化は口腔上皮の歯上皮への分化が引き金となると考えられている。そこで、歯上皮と口腔上皮に発現する遺伝子の違いを調べ、歯上皮の運命決定に関わる因子を明らかにする目的で胎仔からRNAを単離し、シークエンス解析を行い、歯の運命決定に関わる因子を探る。
３）蛍光を指標に胚性幹細胞株由来のエナメル芽・象牙芽細胞の同定と単離を目指す。Dspp-GFP; Amelx-tdTomatoの２重遺伝子組換えマウスから胚性幹細胞株を樹立し、象牙芽細胞及びエナメル芽細胞の誘導の有無を蛍光を指標に同定し、歯胚の象牙芽細胞やエナメル芽細胞との相同性について抗体染色や細胞表面分子解析にて検討する。現在、象牙芽細胞様の細胞の試験管内誘導は報告されているが、エナメル芽細胞の試験管内誘導は報告されていない。困難が予想されるが、まずは象牙芽細胞が誘導される条件を明らかにする。
４）Tamoxifen投与による象牙芽細胞分化関連遺伝子の同定 我々は、Tamoxifen投与にて象牙芽細胞特異的にCreを発現できるDspp-GFP-merCremerマウスを作成した。Cre-LoxPにて遺伝子発現を誘導あるいは欠損させることのできるマウスを用いて象牙芽細胞分化に関わる遺伝子を同定する。
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| Causes of Carryover |
歯の分化の鍵となる歯上皮に特異的に発現する遺伝子を明らかにする目的で、歯胚の歯上皮と口腔上皮に発現する遺伝子の解析を計画した。実際には、胎仔マウスの歯上皮と口腔上皮を凍結切片から顕微鏡下で回収し、RNAを回収したが、使用機器の不調があり、回収したRNA量が十分な解析には足りなかったので、再度RNAを取り直し、RNA解析を持ち越した理由で使用額に差額が生じた。本年度は、差額分を用いてマウスから組織を単離し、RNAの回収し遺伝子解析を行う。また、当初の計画通り、培養や培養細胞の解析のための試薬や抗体を購入する。また、マウスの購入・維持のための予算を使用する。
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Research Products
(5 results)
