2019 Fiscal Year Research-status Report

好中球における新規Rabタンパク質の機能と歯周病での役割

Research Project

Project/Area Number	19K10112
Research Institution	Nagasaki University
Principal Investigator	雪竹英治長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 技術職員 (30380984)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	筑波隆幸長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (30264055) 門脇知子 (筑波知子) 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (70336080)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	好中球 / 新規Rabタンパク質
Outline of Annual Research Achievements	好中球は細菌を貪食し、サイトカインを分泌して生体防御の第一線で機能している。我々は独自の研究から、破骨細胞の分化過程で増大する新規遺伝子Rab44を発見し、さらにRab44が好中球にも発現していることを見出した。一般的にRabタンパク質は細胞内の小胞輸送を制御していると考えられているが、Rab44は他のRabタンパク質とは大きく異なり、いくつかのドメイン構造を有する大きな分子である。本研究は、好中球におけるRab44の機能を解明することを目的としている。in vitro の解析として好中球におけるRab44の遺伝子発現・抑制によるサイトカイン等の分泌や細菌の貪食機能の変化を解析する。in vivo の解析としてRab44のノックアウトマウスを作製し、好中球の生体内での実験を行う。本研究によって好中球や破骨細胞での細胞内小胞輸送の新たな一面を解明し、歯周病での役割解析に繋げる。本研究では破骨細胞や好中球にRab44が特異的に発現しているという我々の独自の知見を基盤にして歯周病への応用を視野に入れた研究を展開する。本研究によるRab44の分子基盤の解明は破骨細胞の骨吸収機構や好中球の分泌機構、貪食・殺菌機構の解明にとって有益な情報となるだけでなく、新しい骨代謝治療薬あるいは歯周病治療薬への手掛かりになる可能性がある。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ・Rab44制御による分泌のバイオイメージング破骨細胞と好中球の共通メカニズムはリソソーム酵素を外に分泌することである。Rab44ノックダウンや過剰発現系を用いて、タイムラプス蛍光顕微鏡あるいは全反射蛍光顕微鏡を用いて分泌機構を解析を行った。現在、再現性の実験を行っている。・Rab44 遺伝子欠損マウスの作製破骨細胞や免疫細胞特異的な組織分布を示すRab44の機能を生体レベルで解析する。Rab44遺伝子欠損マウス作製は既に理化学研究所生体ゲノム工学研究チームとの共同研究により着手している。現在順調に生育しており、繁殖を行っている。
Strategy for Future Research Activity	・好中球におけるRab44結合タンパク質の同定 Rabタンパクの機能を知るためには、どのような分子をエフェクターとしてリクルートするかを知る必要がある。そこで免疫沈降法と質量分析法を用いて解析する。抗Rab44 抗体を用いた内在性のRab44 因子に対する解析と共に、GFPやFlagタグを融合させたリコンビナントRab44タンパク質を発現させて抗タグ抗体による共沈実験も併せて行う。・Rab44遺伝子欠損マウスでの実験的歯周病モデルでの解析野生型とノックアウトマウスの口腔内に、粘調性を付与するため２％カルボキシメチルセルロースと混和したP. gingivalisを経口投与する。投与を３日おきに６週間繰り返す。これをノックアウトマウスと野生型とで比較する。組織骨吸収の程度は、10%次亜塩素酸ナトリウム溶液に浸漬して軟組織を除去した後、セメントエナメルジャンクションから歯槽骨までの高さとして算出する。
Causes of Carryover	未使用金額が620480円ある。これはノックアウトマウスがまだ十分に繁殖していないためである。本年度は解析を進めるため、消耗品費を使用する。