2019 Fiscal Year Research-status Report
立体間葉系幹細胞集塊と軟骨誘導を利用した他家移植歯周組織再生療法開発
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19K10129
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
加治屋 幹人 広島大学, 医系科学研究科(歯), 助教 (00633041)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 間葉系幹細胞集塊 / C-MSCs / 軟骨誘導 / 軟骨内骨化 / 免疫原性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者はこれまでに、間葉系幹細胞(MSCs)と細胞自身が産生する細胞外基質(ECM)を用いて立体的間葉系幹細胞集塊Clumps of MSCs/ECM complexes(C-MSCs)を樹立していた。C-MSCsは、直径1mmほどの立体的細胞集塊であり、人工足場材料を用いずに欠損部に移植され、組織再生を達成する。さらに、C-MSCsに骨分化誘導を施すことで、移植後に膜性骨化の様式を経た高い骨形成能を発揮することを見出していた。
C-MSCsを骨・歯周組織再生療法に臨床応用するためには、その安全性・有効性に加えて患者侵襲・コストなどの問題を解決する必要がある。つまり、他家由来ドナーMSCsから作製したC-MSCsに、高い組織再生能を発揮しつつ、宿主の移植拒絶を生じない細胞性質を付与することが出来れば、患者侵襲がなく培養コストを低減した現実的な骨・歯周組織再生療法となりうる。
発生の過程における骨形成の様式は、骨芽細胞による膜性骨化のみならず、軟骨細胞による軟骨内骨化がある。ここで軟骨細胞は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC分子)の発現が低く免疫原性が低いという特徴がある。そこで、本研究では、C-MSCsに軟骨誘導を施すことで、軟骨内骨化による高い骨形成能を発揮し、低い免疫原性のため移植拒絶を生じない新規の歯周組織再生他家細胞治療法の開発を目指す。
研究初年度には、ヒト骨髄由来MSCsから作製したC-MSCsに軟骨誘導を施し、移植後に軟骨内骨化による骨再生を達成させるための培養条件の検討を行った。その結果、軟骨細胞分化と軟骨基質の産生を促進し、移植後には効果的な骨再生を達成する軟骨誘導C-MSCsの作製方法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、C-MSCsに軟骨誘導を応用することで、軟骨内骨化による高い骨形成能と、移植拒絶を逃れるための低い免疫原性を有する軟骨誘導C-MSCsの樹立を行う。そこで、研究初年度には、ヒト骨髄由来MSCsから作製したC-MSCsを血清不含・異種動物タンパク不含のゼノフリー(XF)軟骨誘導培地で培養し、in vitroでの性質評価を行った。その結果、XF軟骨誘導培地で培養されたC-MSCsの軟骨関連遺伝子発現が経時的に上昇し、これに伴ったSafranin-Oに濃染する軟骨基質の産生亢進が観察された(軟骨誘導C-MSCs)。
さらに、免疫不全動物のSCIDマウス頭蓋冠欠損モデルに移植し、マイクロCTにて骨再生量を定量したところ、広範囲での効果的な骨再生が確認出来た。さらに、移植された細胞が産生した軟骨基質が、骨組織に置換されることでその骨再生を促進していることが経時的な免疫組織染色によって観察された。
また、比較対象として、XF骨分化誘導培地で培養したC-MSCsによる骨再生効果とその再生機序の解析も行った。その結果、骨分化誘導C-MSCsの移植は、移植された細胞が骨芽細胞・骨細胞に分化し骨形成を促進することを見出した。さらに、宿主細胞の骨芽細胞活性も向上し、宿主による骨形成も重要な因子になることを見出した。これらの成果は論文発表している。
以上のことから、研究初年度に軟骨誘導C-MSCsの作製方法がほぼ確定でき、論文発表も行ったことから、本研究は順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
上述したとおり、研究初年度には軟骨内骨化による骨再生能を発揮する軟骨誘導C-MSCsの樹立を行った。そこで、研究2年目には、軟骨誘導C-MSCsの歯周組織再生能を確認するために、ビーグル犬分岐部ClassIII欠損モデルへの移植実験を行う。そこで、ビーグル犬骨髄由来MSCsから作製したC-MSCsに、樹立済みの軟骨誘導法を適用し、自己移植を行い歯周組織再生量をマイクロCTおよび組織観察にて評価する。
期待した歯周組織再生が得られた後に、移植された細胞の振る舞いを確認するために、骨髄由来MSCsから蛍光タンパク質ZsGreen発現細胞株を用意し、そこから軟骨誘導C-MSCsを作製・移植を行う。これによって、移植された細胞が軟骨内骨化を経た組織再生を促進するかを確認する。
研究が順調に進展した場合、ビーグル犬A由来細胞から作製した軟骨誘導C-MSCsをビーグル犬B歯周組織欠損に移植することで、他家移植における歯周組織再生効果・移植拒絶の有無を確認する予備実験に着手する。
一方、ヒト軟骨誘導C-MSCsのMHC分子の発現レベルを確認するために、細胞集塊を破砕後、FACSにて観察する。また、軟骨C-MSCsをヒト末梢血から誘導したT細胞と共培養を行い、T細胞の免疫応答の程度について、FACS、ELISA、T細胞増殖にて評価する。これらのin vitro実験によって、ヒト軟骨誘導C-MSCsの免疫原性が低いことを示す。
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| Causes of Carryover |
ヒトC-MSCsの軟骨誘導のための条件等が、当初予想していたよりも順調に遂行され、in vitroでの培養実験にかかるコストが低く抑えられた。また、他の研究助成財団からの資金によって遂行されたin vivo実験が連動したことで、動物実験解析に関わる抗体等を共通して使用可能となり、試薬費が低額に出来た。これら2つのことから次年度使用額が生じたと考えられる。
研究2年目からは、ビーグル犬の実験が開始するため、動物飼育費が高額になる。とくに、ビーグル犬細胞からの軟骨誘導C-MSCs作製条件検討や、蛍光タンパク発現細胞株の樹立のためにコストが増大すると考えられた。したがって、当初の研究計画においては、2年目の研究遂行は慎重に行う必要があった。しかし、次年度使用額を効果的に利用することで、予算の観点からやや遂行困難と予想されていたビーグル犬の研究を、迅速に進めることが可能になるといえる。
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Research Products
(1 results)
