再生治療が組織にもたらす代謝アダプテーションと３次元的超微細構造変化の解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K10166
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 野崎 剛徳 大阪大学, 歯学部附属病院, 准教授 (30263304)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石濱 泰 京都大学, 薬学研究科, 教授 (30439244) ; 豊田 岐聡 大阪大学, 理学研究科, 教授 (80283828) ; 三浦 治郎 大阪大学, 歯学部附属病院, 助教 (70437383) ; 清水 真人 大阪大学, 歯学部附属病院, 医員 (70380277)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 歯周組織再生 / メタオミクス

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、良好な組織再生を得るために必要とされる組織の微小環境とはどのようなものであるのか、また組織再生に適した微小環境が構築された場合に、組織を構成する各種細胞の配置や関係にいかなる変化が生じるのかを、代謝の変動と細胞の三次元的超微細構造の変化という２つの側面から読み解くことを目的としている。
そしてこれまでに、唾液や歯肉溝浸出液（GCF）を検体とするガスクロマトグラフ/マススペクトロメトリー(GC/MS)を用いたメタボロミクス解析を、固相抽出カラムの使用によって効率的かつ高精度に行う方法を確立し、この方法を用いて歯周病患者と健常者の唾液中に含まれる代謝物を量的・質的に比較した。その結果、自然唾液を検体とした場合には、少なくとも48種類の代謝物の検出量に有意な差があることを明らかにするとともに、そのうち29種の化合物を同定して、ASIA-OCEANIA MASS SPECTROMETRY CONFERENCE 2020 (Macau, China)において報告した。さらに現在は、同じサンプルを検体に用いたプロテオーム解析を行っており、代謝産物量の変動を掌る酵素等の発現変動についての解析を進めている。
また一方で、歯周病モデル動物を作成して歯周組織再生治療を実施し、術後の治癒の各時点におけるGCFの採取と、術後４週における組織の採取を完了した。そして現在は、治癒過程におけるGCF中のメタボローム・プロテオームの経時的変動のメタオミクス解析を行うとともに、細胞の三次元的超微細構造の解析に向けて、組織切片の作成を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初計画では、初年度に動物モデルを用いたオミクス研究を行う予定としていたが、予備的な検討を進めた結果、代謝の変動を高感度かつ正確に捉えるためには、検体の質を均一に保つことが非常に重要であることが明らかになった、そこで初年度に、着目すべき代謝物・代謝経路を絞り込むための研究を先行して行い、GCFのみならず唾液も、歯周病に関連した代謝変動を検知するための検体として有用であること、また自然唾液と刺激唾液では、検出量に有意差がみられる代謝物の種類が異なることを明らかにした。
そして本年度は、ビーグル犬に人工的骨欠損モデルを作成し、FGF-2製剤を用いた歯周組織再生治療を実施した。そして術後の各時点において経時的にGCFを採取しつつ治癒状況の観察を行った後、術後４週間で安楽死を行って下顎骨を採取した。さらに現在は、採取したGCFを検体として、治癒過程の歯周組織におけるメタボローム・プロテオームの経時的変動の検出してその関係性を読み解くためのメタオミクス解析を開始するとともに、免疫組織学的解析と歯周組織構成細胞の三次元的超微細構造の解析を行うべく組織切片の作成を進めている。

Strategy for Future Research Activity

現在はこれまでの結果をもとに、歯肉溝浸出液（GCF）と自然唾液で変動に同期性がみられる代謝物の選出と検証を進めており、今後はさらに同一サンプルを検体にしたプロテオーム解析の結果を重ねることで、代謝産物量の変動を掌る酵素等の発現変動を解析し、検査・診断のターゲットとすべき代謝物・代謝経路を絞り込む予定としている。また、これと並行して、動物モデルから採取した組織再生療法後の治癒の過程の各時点におけるGCF検体と、組織切片を用いて、組織再生療法によってもたらされる良好な創傷治癒・組織再生に際して生じる代謝と歯周組織構成細胞の三次元的超微細構造の変動について、解析を進めていく予定としている。

Causes of Carryover

本年度に実施した動物モデルを用いた研究に要する期間は約4ヶ月超に及ぶが、これに関連した料金の支払いを、当該年度分と翌年度分として請求した助成金を合わせて行う予定であるため、次年度使用額が生じている。