2019 Fiscal Year Research-status Report
細胞接着分子を標的とした選択的オートファジー誘導による口腔癌転移阻止療法の開発
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19K10310
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
林堂 安貴 広島大学, 病院(歯), 講師 (70243251)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡本 哲治 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (00169153)
新谷 智章 広島大学, 病院(歯), 助教 (90403518)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 口腔癌 / 浸潤・転移 / インテグリン / p62 / オートファジー / LC3 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
インテグリンαv発現が，p62を介した選択的オートファジーにより制御されているかを検討するため，インテグリンαvとp62との結合をMammalian two-hybrid法にて解析することを計画した.そこでGAL4 DNA-Binding Domain Cloning VectorであるpMにp62遺伝子を組み込んだpM/p62，Activation Domain Cloning VectorであるpVP16にインテグリンαv遺伝子を組み込んだpVP16/αv作製の作成を完了し，現在，扁平上皮癌細胞への遺伝子導入を計画している．
また，これに先立ち，共免疫沈降法による解析により，インテグリンαvが免疫沈降されたサンプル中にp62が存在していることを確認している．
さらにオートファジー阻害剤であるクロロキン存在下で培養した扁平上皮癌細胞におけるインテグリンαv蛋白とオートファゴソームマーカー蛋白であるLC3の局在を，蛍光二重免疫染色で検索したところ，インテグリンαvとLC3が細胞内でco-localizationしていることが示されたことから，インテグリンαvはオートファゴソーム内に存在し，リソソームによって分解される可能性が示唆された.
さらにMammalian two-hybrid法ではインテグリンαvとp62との結合を確認していないが，共免疫沈降法による解析により，インテグリンαvとp62が扁平上皮癌細胞内で複合体を形成していることを示す所見とを得ている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
インテグリンαVが，オートファゴソーム内に取り込まれ，リソソームによって分解されている所見を確認している．Mammalian two-hybrid 法では，まだ確認していないが，選択的オートファジーのアダプター分子であるp62とインテグリンαVが，細胞内で複合体を形成することを共免疫沈降法で確認している．
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| Strategy for Future Research Activity |
Mammalian two-hybrid 法のためのGAL4 DNA-Binding Domain Cloning VectorであるpMにp62遺伝子を組み込んだpM/p62，Activation Domain Cloning VectorであるpVP16にインテグリンαv遺伝子を組み込んだpVP16/αvを作製している．今後，Mammalian two-hybrid 法にて，p62とインテグリンαVとの結合を詳細に解析する予定である．
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| Causes of Carryover |
2019年度，コロナ感染症等で研究用の物品や試薬の発注が少し遅れたため，予定していた購入額には届かなかった．しかし，次年度は，2019年度購入予定であった物品等を発注する予定である．
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