2019 Fiscal Year Research-status Report

ＨＢp17／ＦＧＦＢＰを制御するエクソソーム由来ｍｉＲＮＡによる口腔癌治療の開発

Research Project

Project/Area Number	19K10332
Research Institution	Hiroshima University
Principal Investigator	新谷智章広島大学, 病院(歯), 助教 (90403518)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	岡本哲治広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (00169153) 林堂安貴広島大学, 病院(歯), 講師 (70243251)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	miR-6887-5p
Outline of Annual Research Achievements	【目的】これまでに、ビタミンD誘導体が、NF-kBシグナル伝達経路を介しHBp17/FGFBP-1の発現を抑制することでin vitro及びin vivoで扁平上皮癌(SCC)の増殖を抑制することを報告してきた。本研究では、ED-71によるHBp17/FGFBP-1の発現低下や増殖抑制が、regulatory chemical messengerを介しているかを明らかにするために本研究を行った。【方法】細胞株としてNA、KO、Ca9-22およびA431を用いた。研究はすべて無血清培養系を用いて行った。0.4nM ED-71処理12時間後のA431細胞株より培養上清(CM)を採取し、CM中のエクソソームを精製した。エクソソームよりRNAを抽出し、miRNAマイクロアレイ解析を行なった後、オンラインプログラムでHBp17/FGFBP-1 mRNAを標的とするmiR候補を検索した。続いて、miR-6887-5p mimicをSCC細胞に導入し、miR-6887-5p mimic過剰発現SCC細胞を分離し、細胞増殖能及びHBp17/FGFBP-1の発現を定量RT-PCR法で比較検討した。【結果】ED-71により発現が上昇するexosomal miR-6887-5pを同定した。A431細胞およびCa9-22細胞のＣＭから精製したmiR-6887-5pは、ED-71処理群でmiR-6887-5pの発現が上昇した。すべてのmiR-6887-5p導入細胞でHBp17/FGFBP-1のmRNA発現およびタンパク発現の抑制を認めた。miR-6887-5p 導入SCC細胞における、細胞増殖では、すべてのSCC細胞株で有意な増殖抑制効果を認めた。【考察】ED-71は、SCC細胞においてCM中にmiR-6887-5pの発現を上昇させ、腫瘍細胞自身および周囲の腫瘍細胞に機能することが考えられた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason miR-6887-5pを含むエクソソームは、培地中にも少量しか分泌されていないため、多くの培地を準備する必要がある。
Strategy for Future Research Activity	Mir-6887-5pがFGFBP/HBｐ17の3’末端の非翻訳領域に直接作用し制御しているかどうかを調べる。ルシフェラーゼアッセイを行うための、発現ベクターを構築したのちに、ルシフェラーゼアッセイを行う。
Causes of Carryover	実験の進行状況が遅れたため、発現ベクターを構築できなかったため。また、コロナウイルス感染のため、抗体の入荷が遅れたため。