ＨＢp17／ＦＧＦＢＰを制御するエクソソーム由来ｍｉＲＮＡによる口腔癌治療の開発

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K10332
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 新谷 智章 広島大学, 病院(歯), 講師 (90403518)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡本 哲治 東亜大学, その他の研究科, 教授 (00169153) ; 林堂 安貴 広島大学, 病院(歯), 講師 (70243251)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: MicroRNA

Outline of Annual Research Achievements

【目的】これまでに、ビタミンD誘導体が、NF-kBシグナル伝達経路を介しHBp17/FGFBP-1の発現を抑制することでin vitro及びin vivoで扁平上皮癌(SCC)の増殖
を抑制することを報告してきた。本研究では、ED-71によるHBp17/FGFBP-1の発現低下や増殖抑制が、regulatory chemical messengerを介しているかを明らかに
するために本研究を行った。【方法】細胞株としてNA、KO、Ca9-22およびA431を用いた。研究はすべて無血清培養系を用いて行った。0.4nM ED-71処理12時間後のA431細胞株より培養上清(CM)を採取し、CM中のエクソソームを精製した。エクソソームよりRNAを抽出し、miRNAマイクロアレイ解析を行なった後、オンラインプログラムでHBp17/FGFBP1 mRNAを標的とするmiR候補を検索した。続いて、miR-6887-5p mimicをSCC細胞に導入し、miR-6887-5p mimic過剰発現SCC細胞を分離し、細胞増殖能及びHBp17/FGFBP-1の発現を定量RT-PCR法で比較検討した。【結果】ED-71により発現が上昇するexosomal miR-6887-5pを同定した。A431細胞およびCa9-22細胞のＣＭから精製したmiR-6887-5pは、ED-71処理群でmiR-6887-5pの発現が上昇した。すべてのmiR-6887-5p導入細胞でHBp17/FGFBP-1のmRNA発現およびタンパク発現の抑制を認めた。miR-6887-5p 導入SCC細胞における、細胞増殖では、すべてのSCC細胞株で有意な増殖抑制効果を認めた。【考察】ED-71は、SCC細胞においてCM中にmiR-6887-5pの発現を上昇させ、腫瘍細胞自身および周囲の腫瘍細胞に機能することが考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究では、microRNA(mimic)を癌細胞へ導入したが、その際、癌細胞により導入効率が異なり、試薬を２，３種類試したため時間を予定より多く費やした。
ルシフェラーゼアッセイ用の、変異型のコンストラクトを作製するのは外注したが、納期に時間がかかった。

Strategy for Future Research Activity

コロナ渦で、物品や試薬の納期に時間がかかることがあるために、必要な試薬は早めに注文するよう心掛ける。R3年度はヌードマウス皮下腫瘍に対してMir-6887-5pの効果を検討する。すなわち、in vitroで、A431細胞とCa9細胞にMir-6887-5pを導入した後に、ヌードマウス皮下に移植する。コントロールにはScramble Mir-RNAを導入した細胞を用いる。2番目に、リポソームを用いたドラッグデリバリーシステムを用いて、遺伝子導入を行う。こちらの方が、より臨床での遺伝子治療に近い研究となる。

Causes of Carryover

実験が遅れており、マウス等の購入ができなかったため。ヌードマウス（約50匹）の購入、Mir-6887-5p、Scramble Mir-RNA、遺伝子導入試薬さらには、細胞培養用の培地などの購入にあてる。