2021 Fiscal Year Research-status Report
地元大阪の印刷所労働者胆管がん組織を使ったがん遺伝子の探索：創薬基盤の構築
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19K10604
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
川村 悦史 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (60419710)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村上 善基 東京医科大学, 医学部, 兼任教授 (00397556)
松原 勤 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (20628698)
河田 則文 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (30271191)
池田 一雄 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (80275247)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 胆管細胞癌 / 胆管癌 / 印刷所 / SKI / p21 / microRNA-3648 / 大阪市 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
胆管癌は、早期診断が難しく、外科的切除術後5年生存率は37％（肝内胆管癌、2005-2015年 国立がんセンター）と予後不良である。我々は、地元の印刷会社で使われた1,2-ジクロロプロパン（DCP=労災認定）による胆管癌の事例(平成24年)をきっかけに癌遺伝子探索を始めた。27年度、我々は同印刷会社症例を含む胆管癌の外科的切除腫瘍組織を用いてRNA発現異常の探索を開始した（JSPS科研費No. 15K08716の助成による）。24例の肝胆道系腫瘍（胆管癌10例、対照として肝細胞癌10例、良性胆道腫瘍4例）の組織検体からRNA抽出液を得て、micro RNA（miR）、messenger RNA(mRNA)に対する高感度マイクロアレイ解析を行なった。28年度、主成分解析により胆管癌の発症と関連する20個の有意なmiRを抽出し得た。この結果に基づき、米国国立生物工学情報センターのdatabaseを用いて特にターゲット効率の高い癌遺伝子SKI (Sloan-Kettering Instituteが発見したタンパク) mRNAおよびmiR-3648を選別した。SKIは癌原遺伝子であり神経管形成や
TGF-βの制御における働きがあるが、胆管癌との関係は明らかにされていない。我々の基礎研究によるとSKIはin vitroでヒト胆管癌細胞の細胞周期を抑える癌抑制遺伝子の働きを示す。令和元年度以降、我々はSKIの機能解析をさらに進め（JSPS科研費No. 19K10604の助成による）、日本肝臓学会西部会（元年12月）、アジア太平洋肝臓学会（2年3月）、日本肝癌研究会（同12月）、日本肝臓学会総会（3年6月）において進捗状況を報告するに至った。さらに原著論文を作成し、投稿準備中である。このように我々はSKIを中心に胆管癌抑制遺伝子の探索と機能解析を続けており一定の成果が得られている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成27年度以降、我々はJSPS科研費No. 15K08716の助成により大阪市で報告された職業性胆管癌症例を含む癌切除組織を検体として、（1）胆管癌の進行と関わる遺伝子の探索（高感度RNAマイクロアレイによる網羅的解析）、（2）(1)の結果のうち化学物質の代謝酵素と関連するRNAの定量的解析（職業性胆管癌の発症機序の推定）、（3）(1)の結果、抽出された100種類を超えるマーカー（microRNAおよびこれが制御するmRNA）に関して、複数の遺伝子webデータベースを使い、胆管癌関連癌遺伝子の選別を行なった。
（1）～（3）により、上記の代謝酵素と関連する遺伝子発現異常は特定されなかった。しかし、上記マイクロアレイと癌遺伝子の公開されたデータベースを基にヒト胆管癌細胞株による実験を行ない、SKI遺伝子が胆管癌の増殖抑制する機能に着目した。
令和元年度以降、助成頂いたJSPS科研費No.19K10604によりSKIとこれを制御する小分子核酸microRNA-3648、SKIとサイクリン依存性キナーゼ抑制因子p21の制御関係について細胞株を使った解析に取り組んできた。現在、SKIがp21 DNAの転写とp21タンパクの発現亢進に関わり、G1期で胆管癌の細胞周期を抑制することを突き止めた。しかし令和3年8月以降、COVID19の感染拡大（第5波および第6波）の為、本研究代表者の臨床業務および実験用試薬の海外からの船便が滞り、進捗に遅れが生じた。
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| Strategy for Future Research Activity |
我々は、令和3年度中にSKIがヒト胆管癌細胞の増殖を抑制する事を示す基礎データを得た。この抑制は、同遺伝子が細胞周期のブレーキ役であるp21タンパクの発現を亢進すること（定量的なmRNA PCRとwestern blotで検証）、及びSKIタンパクがp21 DNAの転写に関わっていること（レポーターアッセイで検証）、によると考えられた。令和4年度以降の方策は、SKI-p21シグナルについて①介在する転写因子の探索、②機能の鍵となるDNA配列の特定、③生体での検証に取組み、発癌機序を解明することである。
実験の計画は、まず、上記①としてp21遺伝子の転写因子の探索である。これは、p21遺伝子の転写開始領域の配列を導入したベクタープラスミドの胆管癌細胞導入効果をルシフェラーゼ活性にて評価する。次に上記②としてSKIおよびp21の抗癌作用の鍵となるDNA配列の探索と機能解析である。これは、該当DNA配列を合成し、ヒト胆管癌細胞株に導入しSKIタンパク発現の亢進を確認する。最後に上記③として胆管癌マウスの作成である。これは、若齢ヌードマウスにヒト胆管癌細胞株を移植する。困難な際、胆管結紮/化学発癌併用したモデルマウスを作成する。
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| Causes of Carryover |
令和元年度以降、我々は胆管癌抑制遺伝子SKIの機能解析を中心にin vitro実験を行ってきた。同3年度、SKIあるいはsiSKIを導入した胆管癌細胞株において、SKIがG1期で細胞周期にブレーキ役として働き（FACS解析）、そこへのDNA再複製誘導を担うCDT1タンパク発現の関わり（蛍光免疫染色）、及びSKIのp21遺伝子転写への関わり（レポーターアッセイ）を示唆するデータを得た。一方、予定通り進まなかった点もあった。その一因は、研究拠点である大阪市は新型コロナパンデミックの中、代表者らはコロナ診療に携わりながら胆管癌研究遂行に努めた事である。市内のコロナ感染の拡大は国内有数であり、緊急事態宣言とまん延防止策が繰返された。研究時間の短縮や海外から納入する試薬の航空便の遅延もあり、十分に解析ができず次年度使用額が生じた。次年度、我々は①SKI flag plasmidのflag結合タンパクの探索（pull downアッセイ）、②本疾患の血清腫瘍マーカーの探索（microRNAの定量的PCR）、③SKI/p21のmRNA機能を亢進（胆管癌増殖抑制）を導くDNA配列(RNAスポンジ)の合成を行う予定である。次年度使用額は、これらの経費に充てたい。
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