Study on Protective Effects of NRF2, an Anti-oxidative Stress Transcription Factor, against Radiation-induced Oncogenesis and Mutagenesis

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K12338
• Research Institution: Radiation Effects Research Foundation
• Principal Investigator: 田邉 修 公益財団法人放射線影響研究所, バイオサンプル研究センター, センター長 (70221398)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉田 稚明 公益財団法人放射線影響研究所, 広島臨床研究部, 副主任研究員 (20832926)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: X線 / 体細胞変異 / 白血病 / 活性酸素 / 酸化ストレス応答 / NRF2 / Keap1 / 造血幹細胞

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、放射線による体細胞変異と発がんに対して、転写因子NRF2により誘導される酸化ストレス応答が防御作用を示すか否かを明らかにすることである。放射線による発がんの原因はDNA損傷による体細胞変異であり、X線によるDNA損傷の主たるメカニズムは、水分子の電離により生ずる活性酸素などのラジカルによる損傷である。研究の方法としては、NRF2欠損変異マウス、あるいはNRF2を恒常的に活性化した変異マウスと、それぞれの対照マウスに対して、全身X線照射した場合としない場合とで、体細胞変異の発生頻度と白血病発症率とを比較することにより、放射線による変異誘発と発がん作用に対するNRF2活性の影響を調べる。NRF2を恒常的に活性化した変異マウスとしては、NRF2の抑制因子であるKeap1の変異マウスを用いる。体細胞変異の発生頻度は、造血幹細胞に由来するクローナルな細胞集団の全ゲノムシーケンス解析により明らかにする。具体的には、NRF2欠損マウスとKeap1変異マウス及びそれぞれの対照マウスにX線照射した場合としない場合とで、骨髄より造血幹細胞を分離、培養して血球コロニーを形成させてクローナルな細胞集団を得る。これら細胞集団からDNAを抽出して全ゲノムシーケンス解析を行い、同一個体の他組織より抽出したゲノムDNAのシーケンス解析結果と比較することにより体細胞変異を同定する。
令和元年度には、体細胞変異の分析のための実験系を確立した。まず、3Gyの全身X線照射及び非照射の野生型マウスの骨髄よりセルソータ等を用いて効率良く造血幹細胞を分離するプロトコル、そして1個ずつの造血幹細胞を各種サイトカインを添加して培養してコロニーを形成し、充分に大きいクローナルな細胞集団を得るためのプロトコルを確立した。さらに、これら細胞から全ゲノムシーケンス解析に必要となる充分量の高品質DNAを精製するプロトコルを確立できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は、放射線による変異と発がんに対する、転写因子NRF2による防御作用を明らかにすることを目的としており、下記計画に沿った進捗と成果に基づき、本研究は概ね順調に進展していると評価できる。
1）体細胞変異に対する防御作用
NRF2欠損マウスとKeap1変異マウス及びそれぞれの対照マウスに全身X線照射した場合としない場合とで、骨髄造血幹細胞に由来するクローナルな血球細胞集団の全ゲノムシーケンス解析を行うことを計画している。造血幹細胞クローンと、同一個体の他組織より抽出したゲノムDNAとのシーケンス解析結果を比較することによりX線照射による体細胞変異を同定する。体細胞変異の頻度を異なるマウス遺伝子型間で比較することにより、放射線による体細胞変異に対するNRF2による防御作用を明らかにする計画である。令和元年度に、これら計画に必要な実験プロトコル、すなわちマウス造血幹細胞の分離、それからのクローナルな細胞集団の取得と高品質DNAの精製などのプロトコルを確立できた。
2）発がんに対する防御作用
放射線誘発白血病モデルとして、C3H/He系統マウスを用いることを計画している。この系統では、白血病の自然発症率が1％以下と低く、3Gyの全身X線照射により約25％の発症率で骨髄性白血病を発症する。そのため、NRF2欠損マウスとKeap1変異マウスに、C3H/He系統への6世代以上の戻し交配の後に、それぞれの対照マウスとともに、X線照射を行う群と行わない群における白血病発症率を遺伝子型ごとに比較することにより、X線照射による白血病誘発効果を算出し、これを異なるマウス遺伝子型間で比較することにより、放射線発がんに対するNRF2による防御作用を明らかにする計画である。令和元年度中に、これら実験に必要なC57BL/6系統のNRF2欠損マウスとKeap1変異マウスを理研バイオリソース研究センターより入手し、C3H/He系統への戻し交配を開始できた。

Strategy for Future Research Activity

放射線による体細胞変異と発がんに対する、転写因子NRF2による防御作用の研究を以下の通り推進する。
1）体細胞変異に対する防御作用
前年度にX線照射及び非照射の野生型マウスの造血幹細胞に由来するクローナルな細胞集団から抽出したDNAを、イルミナ・シーケンサーにより平均深度30倍以上で全ゲノムシーケンス解析を行う。この際に、同一個体の非造血組織より抽出したDNAも参照ゲノムとしてシーケンス解析する。そして、造血幹細胞クローンと参照ゲノムとのシーケンス解析結果とを比較することにより、体細胞変異を同定するための情報解析プロトコルを確立する。さらに、NRF2欠損マウスとKeap1変異マウス及びそれぞれの対照マウスに3GyのX線照射した場合としない場合とで、造血幹細胞クローンと非造血組織の全ゲノムシーケンス解析を行う。両者の結果を比較することによりX線照射による変異誘発効果を定量化し、これを異なるマウス遺伝子型間で比較することにより、放射線による体細胞変異に対するNRF2活性の影響を明らかにする。
2）発がんに対する防御作用
NRF2欠損マウスとKeap1変異マウスのC3H/He系統への戻し交配を計6世代以上継続した後に、対照マウスとともに8週齢時に3Gyの全身X線照射を行った後に長期飼育する。各遺伝子型のマウス数は80匹以上とする。この際に対照として、X線照射を行わない各遺伝子型のマウス80匹以上を長期飼育する。X線照射を行う群と行わない群における白血病発症率を各遺伝子型ごとに比較することにより、X線照射による白血病誘発効果を定量化し、これを異なるマウス遺伝子型間で比較することにより、放射線発がんに対するNRF2による防御作用を明らかにする。白血病の診断は、貧血、肝脾腫、全身状態悪化などの認められる個体について、末梢血及び骨髄細胞のメイギムザ染色及びフローサイトメトリーによる分析と、脾、骨髄などの組織学的分析によって行う。

Causes of Carryover

次年度使用額が生じた理由は下記の通りである。まず、マウス骨髄造血幹細胞の分離、造血幹細胞の培養によるクローナルな細胞集団の取得、そして細胞集団からの高品質DNAの精製などのプロトコルを確立するために、予定していた消耗品に加えて抗体、細胞培地、DNA抽出試薬などを追加で購入する必要があった。そして、NRF2欠損マウス、Keap1変異マウスなどの変異マウス取得のために、凍結受精卵からの個体復元などを行う必要があったために、マウス取得費用が予定額を超過した。これらが原因で、令和元年度に予定していたマウス全ゲノムシーケンス解析委託を令和2年度に行うこととしたため、最終的に次年度使用額が生じた。
次年度使用額の使用計画としては、NRF2欠損マウス及びKeap1変異マウスに全身X線照射した場合としない場合とで、骨髄造血幹細胞を分離するために使用する抗体の購入費用に充てる予定である。