2019 Fiscal Year Research-status Report
A study on DNA damages in germ cells of male mice and germline mutations induced in the offspring
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19K12347
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
増村 健一 国立医薬品食品衛生研究所, 変異遺伝部, 室長 (40291116)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堀端 克良 国立医薬品食品衛生研究所, 変異遺伝部, 主任研究官 (40402995)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 遺伝毒性 / 次世代影響 / DNA損傷 / 遺伝子突然変異 / ゲノム / アクリルアミド / 生殖細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、遺伝毒性物質が生殖細胞にDNA損傷および突然変異を誘発し、次世代個体のゲノムに突然変異(de novo mutation)をもたらすリスクについて検討する。加熱食品に含まれる変異原物質であるアクリルアミドをマウスに投与し、雄性生殖細胞のDNA損傷（DNA付加体形成）が次世代個体ゲノムの突然変異にどのように関与しているかを量的・質的に明らかにすることを目的とする。
gpt deltaマウス（雄8週齢）を用いてアクリルアミドの飲水投与実験を行い、マウス精子におけるDNA付加体形成量および遺伝子突然変異頻度の測定を行った。アクリルアミドの投与用量は、300 ppmを最高用量とし、100 ppm、30 ppmを中・低用量とした。投与期間はOECD TG488が推奨する28日間とし、最終投与3日後に精巣および精巣上体を採取し凍結保存した。精巣および精子からDNAを抽出し、アクリルアミド由来のDNA付加体（N7-dG-GA）をLC-MS/MSで測定するとともに、精子のgpt遺伝子突然変異頻度を測定した。また、次世代個体ゲノムへの影響を調べるため、28日間飲水投与の3日後に各用量群の3匹を無処理雌個体と交配し、次世代個体を得た。雄性生殖細胞の成熟過程を考慮すると、交配時の精子は減数分裂以降に被験物質に曝露されたDNA損傷を持つ細胞とみなすことができる。また、28日間飲水投与の49日後に各用量群の3匹を無処理雌個体と交配し、次世代個体を得た。この場合、交配時の精子は精原幹細胞時に被験物質に曝露され、細胞分裂によりDNA損傷が突然変異として固定された細胞とみなすことができる。それぞれについて投与父個体、母および子の組織を採取し凍結保存した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
レポーター遺伝子導入トランスジェニックマウス（雄gpt deltaマウス）を用いたアクリルアミド28日間飲水投与実験を実施した。最高用量群において投与期間中の体重増加抑制が認められた。また、最終投与3日後に精巣重量の減少が認められた。これは最高用量300 ppmが最大耐量(MTD)付近であり、投与が適切に行われたことを示している。最終投与3日後の精巣および精巣上体を採取し、DNA付加体測定および遺伝子突然変異頻度測定に用いた。投与群の精巣においてDNA付加体（N7-dG-GA）形成量の用量依存的な増加が見られた。引き続き、生殖細胞における遺伝子突然変異頻度の用量反応データを得るため、gptアッセイを実施する。また、最終投与3日後および49日後に各用量群の3匹を無処理雌個体と交配し、次世代個体を得た。ゲノム解析に用いる家族サンプル（父、母、子4匹）を、各用量について1家族以上得ることができた。ただし、最終投与3日後の300 ppm群のみ、3ペアの交配は妊娠に至らず次世代個体が得られなかった。これは高用量のアクリルアミド投与による毒性の影響と考えられた。投与雄個体の生殖組織における遺伝子突然変異頻度を考慮し、次世代個体の全ゲノム解析を計画している。以上のことから進捗状況はおおむね順調である。
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| Strategy for Future Research Activity |
アクリルアミド投与雄マウスの生殖細胞における遺伝子突然変異頻度の用量反応データを得るため、gptアッセイを実施する（継続）。28日間投与3日後（28+3d）および100日後（28+100d）の精巣および精子について遺伝子突然変異頻度を測定し、DNA付加体量と遺伝子突然変異頻度の用量反応データを比較するとともに、投与後の休薬期間の影響を考察する。次世代影響については、最終投与49日後の交配群（28+49d）の最高用量群と対照群について各1家族（投与父、母、子4）を選び、次世代個体のde novo mutationを検出するため、全ゲノムシークエンスを実施する。陽性対象としてENU投与群の１家族サンプルについても全ゲノムシークエンスを実施する。得られた全ゲノムデータを用いて、SNVsの親子間比較によりde novo mutationを検出し、次世代突然変異頻度を算出する。投与雄個体の精子のDNA損傷（DNA付加体形成）と遺伝子突然変異、および次世代個体ゲノム変異の誘発頻度と変異スペクトルを比較し、アクリルアミドの生殖細胞遺伝毒性と次世代突然変異の特徴と感受性の違いについて検討する。
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| Causes of Carryover |
本研究ではマウス全ゲノム配列データを用いて次世代個体ゲノム中の遺伝子突然変異を検出するための情報解析を予定している。コストを抑えて効率的な解析を行うため、今年度と次年度に取得した個体データを一括して次世代変異解析を実施する予定であり、次年度に約100万円の情報解析費用が見込まれるため、次年度使用額とする。
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