2021 Fiscal Year Research-status Report
A study on DNA damages in germ cells of male mice and germline mutations induced in the offspring
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19K12347
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
増村 健一 国立医薬品食品衛生研究所, 変異遺伝部, 室長 (40291116)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堀端 克良 国立医薬品食品衛生研究所, 変異遺伝部, 室長 (40402995)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 遺伝毒性 / 次世代影響 / DNA損傷 / 遺伝子突然変異 / ゲノム / アクリルアミド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、遺伝毒性物質が生殖細胞にDNA損傷および突然変異を誘発し、次世代個体のゲノムに突然変異(de novo mutation)をもたらすリスクについて検討する。雄性生殖細胞のDNA損傷（DNA付加体形成）が次世代個体ゲノムの突然変異にどのように関与しているかを量的・質的に明らかにすることを目的とする。
加熱食品に含まれる変異原物質であるアクリルアミドを雄gpt deltaマウス（8週齢）に300, 100, 30 ppmの用量で28日間飲水投与し、最終投与3日後（28+3d）に精巣および精巣上体を採取し凍結保存した。また、最終投与100日後（28+100d）の雄個体についても組織採取した。精巣からDNAを抽出し、DNA付加体（N7-dG-GA）量を測定した結果、28+3d群においてDNA付加体量は用量依存的に増加した。28+100d群ではDNA付加体は検出されなかった。精巣および精子のgpt突然変異体頻度は28+3d群の300 ppm投与群で有意に増加した。28+100d群では有意な増加が見られなかったが、精子では個体差が大きかった。
次世代個体ゲノムへの影響を調べるため、28日間飲水投与の3日後（28+3d）および49日後（28+49d）に各用量群の3匹を無処理雌個体と交配し、次世代個体を得た。それぞれについて父、母と子の組織を採取し凍結保存した。
今年度は、28+49d群の無処理群および300 ppm処理群、28+3d群の100 ppm処理群、陽性対象としてENU投与群について、各1家族（両親＋子4匹）計24匹の全ゲノム解析を実施した。各個体の肝臓からゲノムDNAを抽出し、次世代シークエンサー（Novaseq, illumina）で塩基配列データを取得した。SNVの親子間比較（トリオ解析）を行い、次世代突然変異頻度を算出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
雄gpt deltaマウスを用いたアクリルアミド28日間飲水投与実験を実施し、最終投与3日後（28+3d）および100日後（28+100d）の精巣および精巣上体を採取した。DNA付加体測定および遺伝子突然変異頻度測定を実施し、投与群の精巣においてDNA付加体（N7-dG-GA）量の用量依存的な増加を認めた。28+3dの精巣と精子において、gpt遺伝子突然変異頻度の有意な増加がみられた。また、最終投与3日後（28+3d）および49日後（28+49d）に無処理雌個体と交配し、次世代個体を得た。精子細胞時に曝露した精子によって交配した28+3d の100 ppm投与群、精原細胞時に曝露した精子によって交配した28+49d の300 ppm投与群および対照群の1家族を対象として全ゲノム解析を実施し、SNVの親子間比較により次世代ゲノムのde novo変異を検出した。研究はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は引き続きアクリルアミド投与雄マウスの子のゲノムに生じたde novo変異の解析を実施する。最終投与3日後の交配群（28+3d）の100 ppm投与群、最終投与49日後の交配群（28+49d）の300 ppm投与群および対照群、陽性対照としてENU投与群の１家族サンプルから得られた全ゲノムデータを用いて、SNVの親子間比較によりde novo 変異を検出し、次世代突然変異頻度を算出した。曝露時期の異なる投与群の子のde novo 変異頻度および変異スペクトルを比較し、特徴の違いを調べる。また、投与雄個体の精子のDNA損傷（DNA付加体形成）と遺伝子突然変異、および次世代個体ゲノム変異の誘発頻度および変異スペクトルを総合的に比較し、アクリルアミドの生殖細胞遺伝毒性と次世代突然変異の相関性について考察する。
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| Causes of Carryover |
本研究ではマウス全ゲノム解析データを用いて次世代個体ゲノム中の遺伝子突然変異を検出するための情報解析を行う。対象となる個体データを一括して次世代変異解析を実施することでコストを抑えることができたため、次年度使用額として追加の情報解析および研究成果発表の費用として使用する。
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