2019 Fiscal Year Research-status Report
Improvement of somatic cell nuclear transfer technology by regulation of histone methylation-dependent imprinted gene expression
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19K16017
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
三浦 健人 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, 特別研究員 (70802742)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 胎盤 / ゲノム編集 / 発生工学 / マウス / インプリント遺伝子 / CRISPR-Cas9 / 体細胞クローン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、母側アレル特異的なヒストンH3のLys27のメチル化 (H3K27me3) の抑制的な修飾により、父側アレル特異的に発現するインプリント遺伝子が報告された。クローンマウス胚においてこれらの遺伝子は、母側アレルのヒストンのメチル化修飾が失われているために、両側アレル性の発現を示す。本研究は、「H3K27me3依存的なインプリント遺伝子の発現異常」と「体細胞クローンで見られる胎盤異常」の関連を明らかにし、それらの遺伝子の発現を正常化することで、クローンの胎盤異常を改善することを目的として行われる。具体的な方法の１つとして、標的遺伝子のノックアウトマウス系統を用いて、クローン胚において父側アレル特異的に標的遺伝子を発現させることで胎盤異常の改善を試みる。
本年度は標的遺伝子に含まれるSmoc1およびPhf17のノックアウトマウス系統をCRISPR-Cas9システムを用いて樹立した。C57BL/6Nの受精卵にCas9 mRNA と２種類のguide RNAを顕微注入した。guide RNAは標的遺伝子の機能ドメインを含む複数のエキソンを挟むようなイントロン内に設計した。得られた産子の標的部位周辺のゲノム配列をPCRおよびシークエンス解析した結果、Smoc1およびPhf17のそれぞれに関して数～数十kbpのゲノム欠損を有するF0個体が得られた。得られたF0個体を野生型C57BL/6Nと交配させた結果、同様のゲノム欠損を有するF1およびF2個体が得られたことから、Smoc1およびPhf17のノックアウトマウス系統が樹立できたと判断した。
また標的遺伝子の１つであるSlc38a4がマウスの胎盤・胎児の正常な発生に必要なアミノ酸トランスポーターであることを、Slc38a4ノックアウトマウスの解析により明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、「H3K27me3依存的なインプリント遺伝子の発現異常」と「体細胞クローンで見られる胎盤異常」の関連を明らかにし、それらの遺伝子の発現を正常化することで、クローンの胎盤異常を改善することを目的としている。そのための方策の１つとして、標的遺伝子のノックアウトマウス系統を樹立し、標的遺伝子の母性アレル特異的ノックアウトマウスをドナーとしてクローン胚を作出することで、クローン胚のインプリント遺伝子発現の異常を正常化させ、胎盤異常の改善を試みる。
本年度は、標的遺伝子であるSmoc1およびPhf17のノックアウトマウス系統をCRISPR-Cas9システムを用いて樹立した。標的遺伝子のノックアウトマウス系統の樹立は、アレル特異的な発現を正常化させたクローン胚の作出にあたり必須のステップであり、今後はこれらのノックマウス系統を用いてノックアウトマウスの胎盤の表現型解析や、クローン胚の発現異常の正常化を行うことが可能となる。
また本年度は標的遺伝子の１つであるSlc38a4のノックアウトマウスを用いて、Slc38a4が胎盤・胎児の発生に必須のアミノ酸トランスポーターであることを明らかにした。Slc38a4が正常な胎盤形成に必須であることから、Slc38a4の発現異常がクローン胎盤異常の原因である可能性が考えられるため、今後はSlc38a4をクローン胎盤異常の責任遺伝子の有力な候補として解析を進めることが可能となる。
以上より、本研究の遂行に必要なノックアウトマウス系統の樹立およびその表現型解析において成果が得られていることから、本研究は順調に進捗していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は本年度に樹立したSmoc1およびPhf17のノックアウトマウス系統を用いて、これらの遺伝子が正常な胎盤形成において果たす役割を明らかにする。具体的には、Smoc1およびPhf17のノックアウト胎児の出生率の算出、ノックアウト胎盤の重量計測および組織学的解析を行い、野生型の表現型と比較する。両遺伝子が胎盤において父性アレル特異的な発現を示すインプリント遺伝子であることから、ノックアウト胎児および胎盤の解析時には、「父性アレル特異的ノックアウト」、「母性アレル特異的ノックアウト」および「両アレルノックアウト」を区別して解析を行う。両遺伝子が正常な胎盤形成に関与することが明らかになった場合は、それらの発現異常がクローン胎盤異常の原因となっている可能性が考えられる。
クローン胎盤異常との関連を明らかにするインプリント遺伝子の中で、本年度ノックアウトマウス系統を樹立したSmoc1、Phf17およびSlc38a4と既にノックアウトマウス系統を樹立・入手しているGab1およびSfmbt2に関しては、それらのノックアウトマウス系統をドナーとして用いてアレル特異的な発現を正常化させたクローン胚を作出し、胎盤異常が改善するか明らかにする。具体的にはクローン胚において両アレル発現を示すことが分かっているこれらの遺伝子の母性特異的ノックアウトマウスをドナーとしてクローン胚を作出することで、正常胚と同様に父性アレルのみから遺伝子発現を示すクローン胚を作出する。クローン胚の作出においては、上述の５つの遺伝子をそれぞれ母性アレル特異的にノックアウトしたマウスや複数の遺伝子をノックアウトしたマウスをドナーとして用いることで、クローン胎盤異常が単一の遺伝子の発現異常に依るものか、複数の遺伝子の発現に依るものかを明らかにする。
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Research Products
(11 results)
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[Presentation] 胎盤特異的インプリント遺伝子Sfmbt2内のマイクロRNAクラスターのインプリント消失は体細胞クローンマウスの胎盤異常を引き起こす2019
Author(s)
井上貴美子,越後貫成美,上村悟氏,的場章悟,廣瀬美智子,本多新,三浦健人,羽田政司,百々由希子,長谷川歩未,持田慶司,小倉淳郎
Organizer
第112回日本繁殖生物学会大会
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