2021 Fiscal Year Research-status Report
Improvement of somatic cell nuclear transfer technology by regulation of histone methylation-dependent imprinted gene expression
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19K16017
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
三浦 健人 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 助教 (70802742)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 胎盤 / ゲノム編集 / 発生工学 / マウス / インプリント遺伝子 / CRISPR-Cas9 / 体細胞クローン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
父側アレル特異的に発現するインプリント遺伝子の中には、母側アレル特異的なヒストンH3のLys27のメチル化 (H3K27me3) の抑制的な修飾によりその発現が制御されているものが存在する。体細胞クローンマウス胚においてこれらの遺伝子は、母側アレルのヒストンのメチル化修飾が失われているために、両側アレル性の発現を示す。本研究は、「H3K27me3依存的なインプリント遺伝子の発現異常」と「体細胞クローンで見られる胎盤異常」の関連を明らかにすることと、それらの遺伝子の発現を正常化することでクローンの胎盤異常を改善することを目的として行われる。具体的な方法の１つとして、標的遺伝子のノックアウトマウス系統を用いて、クローン胚において父側アレル特異的に標的遺伝子を発現させることでインプリント遺伝子の発現量を正常に近づけることで、胎盤異常の改善を試みる。
本年は、標的インプリント遺伝子のうち、Smoc1およびJade1/Phf17の胎盤における機能解析を進めた。Smoc1およびPhf17のノックアウトマウス系統をCRISPR/Cas9システムを用いて樹立し、出生率や胎盤表現型を解析した。Smoc1のノックアウトマウスについては、既報の結果と同様に出生率の低下が認められた。Jade1/Phf17ノックアウトマウスにおいても出生率の低下が認められた。Smoc1、Jade1/Phf17のいずれのKOマウスの胎盤も顕著な組織学的な異常は認められなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、「H3K27me3依存的なインプリント遺伝子の発現異常」と「体細胞クローンで見られる胎盤異常」の関連を明らかにし、それらの遺伝子の発現を正常化することで、クローンの胎盤異常を改善することや出生率を改善することを目的としている。その目的達成の過程で、標的とするH3K27me3依存的なインプリント遺伝子の、正常胎盤における機能を明らかにすることも目指している。
本年度は、標的遺伝子のうち、Smoc1およびJade1/Phf17のノックアウトマウスの表現型を解析した。いずれのノックアウトマウスも出生率の低下は認められたものの、胎盤における顕著な組織学的な異常は観察されなかった。ノックアウト胎盤において機能的な異常が生じている可能性を否定することはできないが、現時点ではいずれの遺伝子も正常な胎盤の機能においては必須の遺伝子ではない可能性が高い。以上の結果は、本研究の目的の一部を達成したことを意味する。
また本年は、クローンマウス作出技術改良のためのアプローチとして、過去にクローンマウス作出が成功していなかった胎盤系列細胞をドナーとして用いた核移植を行った。まずChIP-seq解析により胎盤系列細胞に安定化されたH3K9me3のドメイン構造が存在することを明らかにした。酵素処理によりH3K9me3を取り除いた胎盤系細胞をドナーとして用いることで、対馬系細胞由来のクローンマウス作出に成功した。
以上より、本研究は順調に進捗していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の解析では、Smoc1, Jade1/Phf17のいずれのノックアウトマウスも、胎盤における顕著な組織学的異常を示さなかった。両遺伝子が正常胎盤の形成に関与しているかを詳細に明らかにするため、来年度は胎盤を構成する各種細胞の遺伝子発現解析や胎児のメタボローム解析等を行い、ノックアウト胎盤の機能解析を行う。また、これらの遺伝子を母性アレル特異的にノックアウトしたマウスを作出する。両遺伝子ともホモノックアウトマウスの出生率が低いため、そこからさらに産子を得ることは難しい。そこでヘテロノックアウトの母親と野生型の父親から産まれたヘテロノックアウトマウスを、母性アレル特異的ノックアウトマウスとして用いる。このマウスをドナーとしたクローン胚を作出する。このクローン胚は、正常胚と同様に父性アレルのみから遺伝子発現を示す。もしこのクローン胎盤において胎盤異常が改善すれば、両遺伝子がクローンマウスの胎盤異常の原因の１つであることが明らかになる。また、産子率を求めることで、両遺伝子がクローンマウスの低出生率の原因であるかを明らかにする。また、昨年度解析したSfmbt2、Gab1、Slc38a4も含めて、複数の標的遺伝子を同時にノックアウトしたマウスをドナーとして用いることで、クローンにおける胎盤異常や低出生率が改善するか確認する。これにより、クローン胎盤異常が単一の遺伝子の発現異常に依るものか、複数の遺伝子の発現に依るものかを明らかにする。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症の流行・再流行の影響等もあって実験用試薬・消耗品が全体として品薄となり、納期が半年以上先となる物品もあったため、いくつかに関しては本年度中に購入することができなかった。そのため、研究計画に大きな支障は生じなかったものの、今年度実施予定だった実験のいくつかを行うことができなかった。以上より、物品費の支出額が所要額を下回った。加えて、参加予定だった学会のいくつかがオンライン開催になり、出張も国内移動・国外移動のいずれも大学からの制限があったため、旅費の支出が少なくなった。次年度は、今年度実施予定だったSmoc1およびPhf17のノックアウトマウス系統をドナーにしたクローンマウス作出実験を追加で行う予定であり、それに際して本年度使用するはずだった物品費を使用する。試薬・消耗品に関しては注文したものが徐々に納品され始めており、本年度購入できなかったもののいくつかに関しては次年度に購入できる目処が立っている。次年度参加予定の学会の多くも現時点では現地開催が見込まれている。本年度実施できなかった実験を次年度に行い、その結果を発表するためにも本年度以上の学会参加を予定している。
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