2020 Fiscal Year Research-status Report
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19K16023
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| Research Institution | Shiga University of Medical Science |
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Principal Investigator |
中家 雅隆 滋賀医科大学, 動物生命科学研究センター, 特任助教 (90805459)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 発生工学 / 非ヒト霊長類 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は世代交代に約5年を有するカニクイザルにおいて、F0世代で再現性ある疾患モデル動物を作出する基盤技術の開発を目的としている。これまでの研究からノックアウト法によるモデル動物の作出については、CRISPR/Cas9システムを用いgRNAを工夫することで、片アレル特異的な変異を誘導する技術を開発した。このことから再現よくF0世代で疾患モデル研究に耐えうるモデル動物を作出する基盤技術の開発に目処がついた(Tsukiyama T, Kobayashi K, Nakaya M, et al., Nat Commun, 2019)。一方で、より詳細な疾患発症の分子メカニズムを解明するためにはレポーター遺伝子の挿入や遺伝子置換などの、高度な遺伝子工学的手法が必須となる。しかしながら相同組換えによる大きなフラグメントのノックインは、既存の方法では効率が悪いことが知られている。そこで本年度については本研究課題の発展型として、ノックイン法による疾患モデル動物の作出についても検討を行った。先ずノックイン効率を正確に定量するために、マウスES細胞においてROSA26遺伝子座へ、IRES-NeorもしくはIRES-Zeorを挿入するためのドナーベクターの構築を行い、gRNAの設計と選定を行った。またマウスES細胞においてネオマイシ及びゼオシンによる薬剤選抜の条件を設定した。 次にノックイン効率を高めるために内在性の相同組換え機構に着目した。CRISPR/Cas9システムとの融合を念頭に、相同組換え関連因子を発現させる複数のプラスミドベクターを構築した。現在、構築ベクターのvalidation 及びES細胞におけるノックイン効率の検討を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の目的である世代交代に長い時間を要するカニクイザルにおいてF0世代で再現性ある疾患モデル動物を作出する基盤技術の開発について、前年度までの検討結果により、CRISPR/Cas9システムを用いgRNAを工夫することで、再現性よくモザイク性を抑えたヘテロ変異個体を作出する手法が確立できた。このことから当初の研究計画より大幅な進捗があった。本年度は、より研究を発展させるべく当初のノックアウト法による疾患モデルの作出に限定せず、より詳細な分子メカニズムの解析や表現型を再現するために、GFP等のレポーター遺伝子の挿入や遺伝子置換などの技術開発についての検討にも着手した。ノックイン効率を正確に定量するために、マウスES細胞においてROSA26の遺伝子座へ、IRES-NeorもしくはIRES-Zeorを挿入するためのドナーベクターの構築とgRNAの設計・選定を行った。マウスES細胞においてネオマイシ及びゼオシンによる薬剤選抜の条件を設定した。また内在性の相同組換え因子とCRISPR/Cas9システムの融合を念頭に複数のベクターを設計、構築した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究結果から、カニクイザルにおけるノックアウト法による疾患モデル作出についての技術開発については大幅な進展があったことから、レポーター遺伝子のノックインについても検討の幅を広げる。ゲノム編集技術の発展により様々な遺伝子改変動物が作出されているものの、既存の技術では相同組換えによる大きなフラグメントのノックインは依然として効率が悪い。このことから、既法とは異なる視点での技術開発が必要であると考えられる。そこでノックイン効率を高めるために、DNAの二本鎖切断と同時に複数の相同組換え関連因子を発現するベクターシステムを構築し、人為的に内在性の相同組換え環境の再現を試みる。さらにノックインベクターのホモロジーアームを工夫する等の改良を試みる。現在、既に構築しているノックインベクターのバリデーションを行っており、ES細胞での検討後、初期胚におけるノックイン効率の検討を行っていく。
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