Y染色体CRISPRイメージング技術の確立と哺乳動物の雌雄産み分け

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16026
• Research Institution: Shiga University of Medical Science
• Principal Investigator: 岡村 永一 滋賀医科大学, 動物生命科学研究センター, 特任助教 (30755913)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: Y染色体 / CRISPR / 雌雄産み分け

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではまず、マウス受精卵において、CRISPRイメージング技術による染色体の可視化が実現できるかどうか検証した。テロメア領域は高度なリピート構造であり、培養細胞におけるイメージングが既に論文報告されている。dCas9-EGFP　mRNAはin vitro transcription法により合成した。gRNAは受託合成により入手した。体外受精によって作製したマウス受精卵に対し、dCas9-EGFP　mRNA、および、gRNAを前核あるいは細胞質へ顕微注入した。その結果、2細胞期胚においてテロメア領域が明瞭に標識されることが確認できた。次に、Y染色体を可視化するためのgRNAのスクリーニングをマウスES細胞を用いて実施した。Y染色体上リピート配列を標的としたgRNAを20種類設計した。dCas9-EGFPとgRNAの共発現ベクターをES細胞に導入し、共焦点顕微鏡で観察したところ明瞭にY染色体を可視化できるgRNAは存在しなかった。同様にマウス受精卵においても検証したが、明瞭なシグナルを得ることはできなかった。これらの結果から、より効率的にY染色体へdCas9-EGFPを集積させるための工夫が必要であると考えられた。現在、dCas9-EGFPやgRNAの構造に変異を加えた新しいシステムを用いて試行中である。また、今年度はCRISPRイメージング後の胚について、凍結融解後の生存率についての検証を行った。上述のテロメア領域を可視化したマウス2細胞期胚について、簡易ガラス化を用いて凍結保存を行った。常法により融解したところ、非操作のコントロール群と比較して遜色ない生存率が確認された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

所属研究機関の異動に伴い、実験系の立ち上げに時間を要したため。

Strategy for Future Research Activity

昨年度にTLR7/8リガンドを用いた新しいXY精子の選別法が他研究室により報告された。精度や操作性について、本研究計画の手法と比較を行う予定である。

Causes of Carryover

所属研究機関の異動に伴い研究が一時中断した。そのため、次年度使用額が発生した。昨年度に実施ができなかった実験を効率良く行うための費用、具体的にはマウスやホルモン剤、その他試薬の購入費に充てる予定である。