2019 Fiscal Year Research-status Report
In-cell NMR法を用いたヒト生細胞内核酸の構造安定性および相互作用の評価
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19K16054
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山置 佑大 京都大学, エネルギー理工学研究所, 研究員 (00778095)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | in-cell NMR / 核酸 / 分子混雑 / 四重鎖構造 / 構造安定性 / 分子間相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内は様々な生体分子が高濃度に混在する分子混雑環境である。このような環境下では核酸の立体構造、ダイナミクス、相互作用が試験管内(in vitro)におけるそれとは異なると考えられている。生細胞内でこれらの情報を得るためにin-cell NMR法は有望な手法であるが、核酸を対象とした報告は限られている。これまでに、細胞表面に細孔を形成する毒素蛋白質を用いて核酸を導入することで、ヒト生細胞中の核酸のin-cell NMRスペクトル測定に成功した。本研究では、様々な構造モチーフを有する核酸について、ヒト生細胞内における構造安定性および分子間相互作用をin-cell NMR法を用いて評価することを試みる。
令和元年度は、主にヒト生細胞内における核酸の構造安定性を評価した。核酸塩基のイミノプロトンは交換性プロトンであり、塩基対を形成していないときには容易に水のプロトンと交換する。一方、塩基対中ではイミノプロトンは水素結合を形成し、上記の交換は抑えられている。このため、イミノプロトンと水プロトンの交換速度(交換頻度)はその塩基対が開閉する頻度、すなわち塩基対の安定性を反映する。In-cell NMR法によって14残基のヘアピンRNAに関して交換速度解析を行い、ヒト生細胞内環境の核酸に関し、イミノプロトンの交換速度を得ることに初めて成功した。In vitroの希薄水溶液中および細胞模倣環境中(多糖やタンパク質などの高分子が高濃度に共存する水溶液中)においても同様の解析を行い、生細胞中での交換速度と比較した結果、細胞内においてはヘアピン構造の安定性が希薄水溶液中や細胞模倣環境中とは異なっていることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画の通り、in-cell NMR測定を行い、ヒト生細胞内において、イミノプロトンと水プロトンとの交換速度解析を行った。この結果、ヒト生細胞内環境下の核酸に関して初めてイミノプロトンの交換速度を算出することに成功した。また、in vitroにおける様々な分子との共存環境下でのイミノプロトンの交換速度解析にも成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
予定通り、HIVウイルス由来のRNAとタンパク質に関し、これらの分子間相互作用をヒト生細胞内において観測することを試みる。RNA単独およびRNA-ペプチド複合体についてin-cell NMR測定を行う。
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| Causes of Carryover |
当初の予想よりも得られたin-cell NMRスペクトルの質が良く、予定していた15Nによる安定同位体標識RNAの調製を必要としなかったため次年度使用額が生じた。次年度のRNAとペプチドの相互作用解析においては今年度よりも複雑なin-cell NMRスペクトルの解析が必要になると予測されるため、安定同位体標識体の調製に次年度助成金を用いる予定である。
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[Journal Article] Versatility of RNA-Binding Proteins in Living Cells2019
Author(s)
Kurokawa R., Takeuchi A., Shiina N., Katahira M., Yamashita T., Matsuno Y., Hitachi K., Ishigaki S., Hamad N., Yoneda R., Ueda N., Iida K., Hosokawa M., Hagiwara M., Iida M., Mashima T., Yamaoki Y., So M., Nagata T., Sobue G., Kondo K., Watanabe H., Uchihashi T.
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Journal Title
Biomedical Sciences
Volume: 5
Pages: 7-13
DOI
Open Access
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[Presentation] Development of anti-prion RNA aptamers and destruction of the Alzheimer's disease-related complex2019
Author(s)
T. Mashima, M. Iida, J. H. Lee, Y. Yamaoki, M. So, Y. O. Kamatari, T. Hayashi, M. Kinoshita, K. Kuwata, T. Nagata, M. Katahira
Organizer
International Symposium on Nucleic Acids Chemistry 2019(ISNAC2019)
Int'l Joint Research
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