雄性生殖細胞におけるエピゲノムの成立機構と、その次世代に及ぼす影響

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16141
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 北 加奈子 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (60813631)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: エピジェネティクス / de novo DNA メチル化 / レトロトランスポゾン / マウス精子形成 / PIWIファミリータンパク

Outline of Annual Research Achievements

今年度においても、PIWIファミリータンパク質の１つであるMIWI2と機能的関連を有するタンパクとして同定したMORC3の胎仔期精巣での機能解析を継続的に行った。
生殖細胞特異的Morc3コンディショナルノックアウトマウスの胎仔期精巣では野生型に比べて、レトロトランスポゾン領域のde novo DNAのメチル化が低下していること、piRNAの総産生量が半分程度に減少していること、などを明らかにしてきた。これらのことから、Morc3コンディショナルノックアウトマウスで認められるpiRNA産生量の低下、及びそれによるMILI及びMIWI2に結合するpiRNA量の減少が、胎仔期精巣におけるレトロトランスポゾン領域のde novo DNAのメチル化の低下に影響していることが示唆された。更に、胎仔期piRNA clusterから転写されるpiRNA前駆体の転写レベルを、野生型とMorc3コンディショナルノックアウトマウスの胎仔期精巣を実験材料に、RT-qPCR法を用いて調べた。その結果、Morc3コンディショナルノックアウト精巣では、piRNA依存的なレトロトランスポゾン配列近傍からのpiRNA前駆体の転写量が野生型と比べて有意に減少していることが分かった。このことから、MORC3は、piRNA生産経路の最初の段階である、piRNA前駆体の転写機構に関与していることが分かった。
一方、胎仔期生殖細胞におけるde novo DNAメチル化機構に関わる新たな分子を探索するために、Line-1の制御領域を認識し結合するZFタンパクを発現するTGマウスの胎仔期精巣を必要量採取し、抗Flag抗体を用いて免疫沈降を行い、質量分析によりMIWI2の標的領域に結合するタンパクとして、CNOT1(CCR4-NOT transcription complex subunit 1)を新たに同定した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

予備的成果から、MORC3は、胎仔期雄性生殖細胞において、レトロトランスポゾン領域、特にLINE-1のde novo DNAメチル化の獲得に大きな役割を果たしていることが示唆された。また、NGS解析により、piRNAの総産生量が半分程度に減少していることも明らかにしてきた。これらのことから、Morc3コンディショナルノックアウトマウスで認められるpiRNA産生量の低下、及びそれによるMILI及びMIWI2に結合するpiRNA量の減少が、胎仔期精巣におけるレトロトランスポゾン領域のde novo DNAのメチル化の低下に影響していることが示唆された。そこで、今年度、胎仔期piRNA clusterから転写されるpiRNA前駆体の転写レベルを、野生型とMorc3コンディショナルノックアウトマウスの胎仔期精巣を実験材料に、RT-qPCR法を用いて調べた。その結果、Morc3コンディショナルノックアウト精巣では、piRNA依存的なレトロトランスポゾン配列近傍からのpiRNA前駆体の転写量が野生型と比べて有意に減少していることが分かった。このことから、MORC3は、piRNA生産経路の最初の段階である、piRNA前駆体の転写機構に関与していることが分かった。以上の研究成果を学術論文として現在投稿中である。
一方で、胎仔期雄性生殖細胞におけるde novo DNAメチル化機構に関わる新たな分子の探索を行い、質量分析によりMIWI2の標的領域に結合するタンパクとして、CNOT1(CCR4-NOT transcription complex subunit 1)を同定した。
以上のことから、順調に実験は遂行できており、次年度も引き続き実験計画に基づいて進めていきたいと考えている。

Strategy for Future Research Activity

胎仔期生殖細胞におけるde novo DNAメチル化機構に関わる分子の候補として、CNOT1(CCR4-NOT transcription complex subunit 1)を同定した。共同研究先である、山本雅先生（沖縄科学技術大学院大学(OIST)）より、CNOT1(Fl/Fl)マウスの譲渡を受け、そのマウスとTnap-Creマウスとを交配し、[CNOT1(Fl/Fl),Tnap-Cre]コンディショナルノックアウトマウスの作製に成功した。予備的成果より、CNOT1コンディショナルノッ クアウト雄マウスでは、妊孕性の低下が認められた。次年度は、この生殖細胞特異的CNOT1コンディショナルノックアウトマウスを用いて、CNOT1の生殖細胞における機能を詳細に解析していきたいと考えている。

Causes of Carryover

妊娠・出産の為、実験が滞ったため。
CNOT1コンディショナルノックアウト精巣を実験材料にRNA-seqを行いたいと考えている。