2019 Fiscal Year Research-status Report
代謝関連アミノ酸の多次元キラルHPLC法構築と精神・神経疾患の早期診断法開発
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19K16343
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| Research Institution | Fukuoka University |
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Principal Investigator |
古賀 鈴依子 福岡大学, 薬学部, 助教 (20804545)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 分析化学 / 光学分割 / 多次元HPLC / 代謝関連アミノ酸 / キラルアミノ酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
精神・神経疾患の早期診断法開発のため、2019年度は予備検討において生体内のD-アミノ酸酸化酵素（DAO）活性変化に伴う含量変化を示した代謝関連アミノ酸であるシトルリンおよびオルニチン鏡像異性体に対象を絞り、三次元HPLC分析システムを構築した。
一次元目の逆相分配には微粒子充填型ODSカラム（1.0 mm x 250 mm）を用い、二次元目には陰イオン交換カラム（1.5 mm x 150 mm）を、三次元目には2-ナフチル-L-アラニンを光学中心として有する光学分割カラム（1.5 mm x 250 mm）を選択し、各分離系について条件を精査した。一次元目および二次元目において、シトルリンおよびオルニチンをD体とL体の混合物としてそれぞれ他の内在性化合物から分離し、三次元目においては約50分以内にいずれも分離度1.59以上の良好な分離が達成された。定量性を検討した結果、得られた検量線は全て相関係数 0.9997以上の直線性を示した。また、標品アミノ酸および尿試料を用いて検討を行った再現性については日内・日間変動のいずれもRSD 6.7％以下であった。
構築した三次元HPLCシステムを用いてDAO欠損マウス及びコントロールマウスの尿試料分析を行った結果、尿中の生体成分による定量妨害を受けることなく良好な分析が可能であり、双方においてシトルリンおよびオルニチン鏡像異性体の存在が認められた。コントロールマウス尿中シトルリンおよびオルニチンの％D値がそれぞれ7.5％、31.9％であったのに対し、DAO欠損マウス尿中においてはそれぞれ55.0％、83.3％であり、DAO欠損に伴う％D値の有意な増加が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度はシトルリンおよびオルニチン鏡像異性体を分析対象とし、実試料における高選択的分析を可能とする三次元HPLCシステムを構築する計画であった。一次元目の逆相分配、二次元目の陰イオン交換分離、三次元目の光学分割条件の精査、生体試料を用いた条件の最適化およびバリデーションを行い、三次元HPLCシステムの構築に成功した。また、様々な生体試料を用いた検討を進めており、当初の計画通り進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度は、2019年度に構築した三次元HPLCシステムを基盤に、芳香族アミノ酸代謝化合物やN-メチル化アミノ酸など他の代謝関連アミノ酸鏡像異性体へと分析対象を拡充する。また、各種疾患モデルマウスおよびヒト臨床検体の収集を進めると共に、様々なDAO活性を有するマウス尿中・血中におけるキラル識別含量解析を行い、DAO活性評価指標の探索を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
2019年度は、九州大学薬学部との共同研究により実験動物の生体試料を効率的に採取できたため、購入費が軽減され次年度使用額が生じた。
2020年度は、シトルリンおよびオルニチン以外の代謝関連アミノ酸へと分析対象の拡充を計画しているため、差額分を光学分割カラム作成に必要な充填剤の購入に充てる。
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