2020 Fiscal Year Research-status Report
The clarification of acetylcholine-PAK signaling in aversive learning and cognitive memory formation
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19K16370
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
山橋 幸恵 藤田医科大学, 総合医科学研究所, 助教 (00793481)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | アセチルコリン / PAK / リン酸化 / スパイン / PKC / D2R-MSN |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、PAK基質の包括的探索を行うことで、アセチルコリンの作用機序を解明すると共に、忌避学習・嫌悪記憶や認知記憶の形成におけるアセチルコリン-PKC-PAKシグナルの役割を明らかにすることを目指している。本年度は、１）アセチルコリン-PKC経路の下流におけるPAK基質候補の同定、２）個体内における樹状突起スパインの形態解析に取り組み、以下の研究結果を得た。
１）アセチルコリン-PKC経路の下流におけるPAK基質候補の同定：最初に、前年度に引き続き、リン酸化プロテオミクスを行い、PAK基質候補を増やした。次に、線条体スライスをPKC活性剤PEP-005で刺激し、その抽出液をリン酸化蛋白と特異的に結合する14-3-3蛋白質を固相化したアフィニティビーズと混合することでPAK基質候補を濃縮し、質量分析により２００種類以上のPAK基質候補を同定した。その候補の中、情動学習行動を司る側坐核で最も強く発現しているRac 不活性化因子BCRに注目し、アセチルコリン-PKC-PAK経路との関連性を調べた。そのために、線条体スライスをアセチルコリン作動薬で刺激し、14-3-3プルダウンアッセイを行なった。その結果、BCRの14-3-3との結合量は増加し、PKC及びPAK阻害剤の前処理では抑えられた。このことから、アセチルコリン-PKC経路の下流でPAKがBCRをリン酸化することが示唆された。
２）個体内における樹状突起スパインの形態解析： PAK変異体(不活性型及び活性型)をCre依存的に発現するFlex-AAVを、D2R-MSN特異的にCreを発現するA2A-Creマウスの側坐核に導入した。３週間後、PAK変異体の発現によるスパインの形態変化を観察し、個体内のD2R-MSNにおいてPAKの活性化がスパインの形成及び成熟を促進することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記のようにPAK基質候補としてBCRが同定された。Rac 不活性化因子であるBCRはもともとスパインの形成及び成熟に関与することが知られている。本年度は、アセチルコリン-PKC経路の下流でPAKがBCRをリン酸化することを示唆する結果を得た。また、個体内のD2R-MSNにおいてPAKの活性化がスパインの形成及び成熟を促進することも明らかにした。以上のことから、アセチルコリン-PKC-PAK経路とスパインの形成及び成熟との関連性が明らかになった。
以上、本研究の目的である、神経細胞内におけるアセチルコリンの作用機序及び忌避学習・嫌悪記憶や認知機能におけるアセチルコリン-PAKシグナルの役割の解明が達成つつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度、アセチルコリン-PKC経路の下流でPAKがBCRをリン酸化することを示唆する結果を得た。次年度は、アセチルコリン-PKC-PAK経路によるBCRのリン酸化とスパインの形態変化や情動学習との関連性を検証すべく、以下の実験を行う予定である。
１）BCRのリン酸化部位の同定：リン酸化プロテオミクスにより、PAKによるBCRのリン酸化がキナーゼドメイン(79-502aa)に集中していることを本年度、明らかにしている。また、このドメインはスパインの形成に必要であることが知られている。今後、BCR変異体を作成し、in vitro キナーゼアッセイや14-3-3プルダウンアッセイ等により、リン酸化部位を決定する。
２）個体内における樹状突起スパインの形態解析：アセチルコリン-PAKシグナルによるスパイン形態変化の解析のため、BCRの非リン酸化型変異体をCre依存的に発現するFlex-AAVを精製し、D2R-MSN特異的にCreを発現するA2A-Creマウスの側坐核に導入する。３週間後、この変異体の発現によるスパインの形態変化を観察する。
３）マウスの情動学習や認知機能の解析：受動回避試験を行い、アセチルコリン下流でリン酸化したBCRが忌避学習・嫌悪記憶に関与するかを検討する。A2A-Creマウスの側坐核にPAK基質のリン酸化耐性型変異体を発現するFlex-AAVを注入して、忌避学習・嫌悪記憶が低下するのかを検討する。また、コリンエステラーゼ阻害剤による忌避学習・嫌悪記憶の亢進がD2R-MSN内のBCRのリン酸化耐性型変異体により抑制されるのかも検討する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウィルスの影響により、予定していた学会参加を見送ったため「旅費」の未使用額が生じた。また、マウス繁殖や実験が遅れた結果、「物品費」の未使用額が生じ、本年度予定していた、忌避学習・嫌悪記憶におけるアセチルコリン-PAKシグナルの役割の解明に関する論文の投稿を延期したため、「その他」の未使用額も生じた。次年度は、本年度で使用を見送っていた論文投稿料、論文投稿後の追加実験で使う実験動物用マウスや分子生物学用試薬の購入、学会参加費に使用する予定である。
本年度は新型コロナウィルスの影響により、学会参加の見送り、マウス繁殖や実験の遅れ、論文投稿の延期のため、「旅費」、「物品費」、「その他」に未使用が生じた。次年度は、本年度使用を見送っていた論文投稿料、論文投稿後の追加実験で使う実験動物用マウスや分子生物学用試薬の購入、学会参加費に使用の予定である。
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