2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of new in vitro phenotypic assay to detect the artemisinin resistant Plasmodium falciparum
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19K16631
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
池田 美恵 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 博士研究員 (40734314)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | アルテミシニン耐性 / Pyknotic / 熱帯熱マラリア原虫 / RSA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アルテミシニンを主軸とした治療法の普及によりマラリア死亡数は大幅に減少したが、耐性原虫の出現が東南アジアで報告されている。しかし現在のin vitro耐性原虫検出法であるring-stage survival assay(RSA) は共に顕微鏡観察を必要としサンプルを得るまでの手技が煩雑であり、定量的な耐性評価が難しいという欠点がある。
本研究は、ELISA法を用いて従来法よりも簡単・迅速かつ客観的な解析を可能にし、アルテミシニン耐性レベルを定量的に評価できる改良型in vitro耐性検査法を開発することである。そのためにアルテミシニン処理によって出現するPyknoticと呼ばれる死原虫に注目しその解析を行った。
耐性原虫と感受性原虫それぞれをearly ring-stageに同調させ、24時間アルテミシニン処理によるPyknoticの形成率を解析した。耐性原虫のうち、MRA-1236は0.4、 MRA-1238は0.5、MRA-1240では0.3または0.8であった。感受性原虫3D7, FCR3とMRA-1237では0.5, 0.7と0.4であり、少なくとも24時間のアルテミシニン処理という条件では耐性原虫と感受性原虫間のpyknotic形成率は差が見られなかった。
一方で、フィールドサンプルにおいては、2014年度調査サンプルと2017年度調査サンプル間で、アルテミシニン耐性レベルの上昇が見られ、それに伴いpyknoticの出現頻度も上昇していた。
フィールドサンプルと培養原虫での結果について明らかにするため、培養原虫でのアルテミシニン処理時間をRSA同様の6時間に短縮し、フィールドサンプルとの相違を再解析し、アルテミシニン処理によるpyknoticの影響を評価する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、アルテミシニン処理によって出現するPyknoticについて、その出現頻度がアルテミシニン耐性度に影響するのかを解析した。
実験室での培養株を用いた解析では、耐性株と感受性株のpyknotic形成率には有意な差が見られなかったが、この結果は以前採取したフィールドサンプルの結果とは異なる。この差異がアルテミシニン処理時間の差異、pyknoticの出現パターンによっては、耐性原虫の中にもいくつかのタイプがあるのではないかと考えられる。
pyknoticの形成方については、薬剤処理での誘導が可能であるため、すでに検討済みである蛍光色素を用いた方法でその性質を評価する計画である。
また、本年度はウガンダの隣国であるコンゴ民主共和国でのエボラ出血熱のアウトブレイクによってフィールド調査が不可能であった。継続していたフィールド調査が中断してしまったが、その代わりにラボでのRSAやpyknoticの検討に十分な時間を費やすことが出来、定量的RSAについての論文作成も進んでおり、近く投稿予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き培養原虫を用いてアルテミシニン処理よるpyknoticの形成が耐性感受性評価と関連するの科かを解析する。
最終的にRSAの解析にELISAを導入することを計画しているが、PyknoticがELISAの測定値に影響するのかは不明である。PyknoticがELISA測定値にどのように影響するのか、その影響が大きい場合の補正方法、または代替法が必要かをを検討する。
アフリカにおいて、アルテミシニン耐性に関する新たな耐性候補遺伝子が報告されている。この遺伝子の変異の有無をウガンダサンプルにおいて解析し、最終目標である定量的RSAでの耐性レベル評価の裏付けとなり得るかも検討する。また、ウガンダから持ち帰った凍結マラリア感染血液ストックからクローンを得ている。ウガンダクローン株でのアルテミシニン耐性についても解析し、特にPyknotic出現頻度が東南アジア株と異なるのかを解析する予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度はアルテミシニン処理によるpyknotic形成について解析を行ったが、それらに必要な薬剤については輸入品であるため調達に時間がかかる。そのため、本年度研究開始以前に保持していた研究費で試薬等を購入し、またマラリア培養にかかる物品等については並立して保持している特別研究員奨励費で賄ってたため、当該年度の支出が低くなり、次年度使用額が生じた。
また、前年度12月から産休に入ったため、一旦研究を中断したことも今回の支出が低くなった理由である。
次年度は、この次年度使用額としてのこった予算は、すでに購入済みの培養液の自動分注装置の改良などに用いる予定である。また、次年度予算の分は装置改良以外の薬剤試験用の試薬やマラリア培養の試薬、プレート類などの消耗品に用いる。さらに最近、マラリア原虫のアルテミシニン耐性に関与する新たな遺伝子が発見されているため、本研究でのassayとの関連を調べるための分子生物学試薬の購入も予定している。
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[Journal Article] ecovery and stable persistence of chloroquine sensitivity in Plasmodium falciparum parasites after its discontinued use in Northern Uganda.2020
Author(s)
Balikagala B, Sakurai-Yatsushiro M, Tachibana SI, Ikeda M, Yamauchi M, Katuro OT, Ntege EH, Sekihara M, Fukuda N, Takahashi N, Yatsushiro S, Mori T, Hirai M, Opio W, Obwoya PS, Anywar DA, Auma MA, Palacpac NMQ, Tsuboi T, Odongo-Aginya EI, Kimura E, Ogwang M, Horii T, Mita T.
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Journal Title
Malar Journal
Volume: 18
Pages: 76
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
