2020 Fiscal Year Research-status Report

DNA二本鎖切断を誘導し、口腔癌の原因となる歯周病菌と病原因子の特定

Research Project

Project/Area Number	19K16647
Research Institution	Oita University
Principal Investigator	手島理絵大分大学, 医学部, 客員研究員 (30816187)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	パルスフィールド電気泳動 / 好気性菌 / 上清
Outline of Annual Research Achievements	歯周病原因菌のスクリーニングと解析入手していたATCCや他の研究機関で分離された菌株を使用し、SAS細胞に歯周病菌を感染させ、一定時間感染させた後、感染細胞を回収し、パルスフィールド電気泳動を行い、DNAをEtBrにて染色し評価を行った。昨年に引き続き、好気性菌である、Streptococcus anginosus、Streptococcus sanguinis （ATCC105576）、Streptococcus gordoni（ATCC10558）、Enterococcus faecalis （ATCC19433）、Streptococcus mutance(ATCC25175)について検討を行った。好気性菌であり、細胞の培地内で急速に増加するため、MOIを小さくしても、24時間後には細胞が死滅するため、感染時間の短縮を行ったが、6時間後ではDSBを示唆する所見は得られなかった。SAS細胞にAggregatibacter actinomycetemcomitansを感染させた場合、感染24時間後から免疫蛍光染色にてDNA損傷を示すγH２AXが見られるようになり、DSBの蓄積を確認することができた。そして、パルスフィールドでも感染24時間後からDSBが確認できるようになっているため、DBSの蓄積は24時間後以降に認められる可能性があると思われる。よってDBSの蓄積には24時間以上の感染が必要と思われる。好気性菌の菌液の感染では24時間感染させることは困難であるが、これらの菌は液体培地で培養を行っているため、上清を使用し検討を行った。好気性菌の上清をSAS細胞に感染させ、24時間後に感染細胞を回収し、パルスフィールド電気泳動を行ったが、DSBを示唆する所見は認めなかった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason Treponama denticola（spirochaeta）の培養が困難であり、培地、培養温度、培養時間の条件を変更し培養を試みたが、十分な量の菌を得ることが出来ず、Treponama denticolaをSAS細胞に感染させることができなかった。好気性菌に関しては上清を感染させ、24時間後に感染細胞を回収しパルスフィールド電気泳動にて評価を行ったが、DSBを示唆する所見は認めなかった。 Polphyromonas gingivalisに関しては、Caspase inhibitorを用いてアポトーシスの抑制下で感染させたところ、パルスフィールド電気泳動にてバンドの消失を認めたため、Polphyromonas gingivalisはアポトーシスを誘導していると思われる。また、lysis buffer(1mg/ml proteinaseK, 100mM EDTA, o.2% sodium deoxycholate, 1% sodium laurylbsarcosine)を添加せずにパルスフィールド電気泳動を行ったところ、細胞膜が菌によって破壊されている所見を認めたため、Polphyromonas gingivalisの菌液の感染ではDBSの誘導を確認することはできなかった。大分大学の口腔癌患者の臨床検体を用いて、唾液、歯垢、組織のマイクロバイオームを調べた結果、口腔癌患者のみから検出されたのはPorphytmonas gingivalisとPrevotella intermediaの2菌であったので、Prevotella intermediaをATCCより入手し培養を試みたが、十分な菌量を得ることが出来なかった
Strategy for Future Research Activity	口腔内では菌はバイオフィルムを形成し、相互作用により歯周病を発症しているため、1種類の菌のみの感染ではなく、菌を混和させて感染を試みる。特にPorphytmonas gingivalisはキーストーンとしても知られているため、Porphytmonas gingivalisと他の菌と組み合わせての感染やPorphytmonas gingivalisの上清を感染させ検討していきたい。大分大学の口腔癌患者の臨床検体を用いて、唾液、歯垢、組織のマイクロバイオームを調べた結果、腫瘍組織内ではCapnocytophaga sputigena, Fusobacterium nucleatum, Treponema denticolaが増加していたため、まだ入手していないCapnocytophaga sputigena,を入手し、検討を行いたい。
Causes of Carryover	現在所有している菌株での感染実験でDSBを示唆する所見が得られないため、次のステップに進むことができていない。新たな菌（Capnocytophaga sputigena、Prevotella intermedia）使用し、また、既存の菌株を混和させ感染を行い、DSB誘導のがあるかを検討していきたい。