2022 Fiscal Year Research-status Report
DNA二本鎖切断を誘導し、口腔癌の原因となる歯周病菌と病原因子の特定
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19K16647
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
手島 理絵 大分大学, 医学部, 客員研究員 (30816187)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | パルスフィールド電気泳動 / 歯周病菌 / 好気性菌 / 嫌気性菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯周病原因菌のスクリーニングと解析
入手していたATCCや他の研究機関で分離された菌株を使用し、SAS細胞に歯周病菌や上清を感染させ、一定時間感染させた後、感染細胞を回収し、パルスフィールド電気泳動を行い、DNAをEtBrにて染色し評価を行った。
好気性菌である、Streptococcus anginosus、Streptococcus sanguinis （ATCC105576）、Streptococcus gordoni（ATCC10558）、Enterococcus faecalis（ATCC19433）、Streptococcus mutance(ATCC25175)について検討を行った。
これら好気性菌は細胞の培地内で急速に増加するため、MOIを小さくしても、24時間後には細胞が死滅してしまう。しかし、SAS細胞にAggregatibacter actinomycetemcomitansを感染させた実験結果より、DBSの蓄積には24時間以上の感染が必要であるため、液体培地で培養した上清を感染させることとした。1種類の菌の上清をSAS細胞に感染させ、24時間後に細胞を回収し、パルスフィールド電気泳動を行ったが、DSBを示唆する所見を得ることができなかった。
口腔内では菌はバイオフィルムを形成し、相互作用により歯周病を発症しているため、1種類の菌のみの感染ではなく、複数の菌の上清をを混和させて感染を試みたが、DBSを示唆する所見は認めなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
コロナの影響により、実験に十分な時間を費やすことが困難となったことが主な理由である。
Treponama denticola（spirochaeta）の培養が困難であるため、昨年と同様、培地、培養温度、培養時間の条件を変更し培養を試みているが、十分な量の菌を得ることが出来ず、Treponama denticolaをSAS細胞に感染させることができていない状態である。
好気性菌に関しては菌体の感染では十分な感染時間を得ることができないため、上清をSAS細胞に感染させ、24時間後に感染細胞を回収しパルスフィールド電気泳動にて評価を行ったが、DSBを示唆する所見は認めなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
好気性菌に関しては、上清を感染させたが、DBSを示唆する所見を得ることはできなかった。
嫌気性菌であるFusobacterium nucleatumは過去に感染実験を行っており、DBSは蓄積されなかったが、F.nucleatumがヒトの細胞に侵入し、細胞内に侵入すると核に向かって移動しており、ホストのDNAを改変する可能性があるとの報告もあるため、再度F.nucleatumについて感染条件の変更やほかの嫌気性菌と混和しての感染なども行っていく予定である。
Porphytmonas gingivalisはキーストーンとしても知られているため、Porphytmonas gingivalisに関しても他の菌と組み合わせての感染やPorphytmonas gingivalisの上清を感染させ検討していきたい。
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| Causes of Carryover |
現在所有している菌株での感染実験でDSBを示唆する所見が得られず、次のステップに進むことができないため、次年度使用額が生じている。
好気性菌ではDBS誘導が生じる可能性が低いため、嫌気性菌でDSB誘導があるかを検討していく予定である。嫌気性菌であるFusobacterium nucleatumは過去に感染実験を行い、DBSは蓄積されなかったが、F.nucleatumがホストのDNAを改変する可能性があるとの報告もあるため、再度F.nucleatumについて感染条件の変更や他の嫌気性菌と混和しての感染なども行っていく予定である。
現在所有している口腔内細菌ではDSB誘導は生じていないため、新しい菌株を使用することを計画している。以前、大分大学の口腔癌患者の臨床検体より口腔癌患者のみから検出されたPrevotella intermediaをATCCより入手し培養した際、十分な菌量を得ることができなかったが、再度入手し、培養を行いたい。また、口腔腫瘍内で増加していたCapnocytophaga sputigenaやFusobacterium nucleatumもATCCより入手したいと考えている。
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