2019 Fiscal Year Research-status Report
Role of TREM-1 signaling by PGLYRP1/PGN in inflammatory diseases
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19K16654
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
細田 浩司 東京農業大学, 生命科学部, 准教授 (40408662)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 炎症性疾患 / TREM-1 / ペプチドグリカン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
TREM-1はマクロファージの膜受容体として、炎症性サイトカイン産生を増強し敗血症の病態を悪化させる。また、TREM-1は様々な非感染性の慢 性炎症性疾患の増強因子として働くことも明らかにされている。近年、好中球顆粒成分のペプチドグリカン(PGN)認識タンパクPGLYRP1が菌体の PGNとともにTREM-1リガンドとして働くことが報告された。しかし、PGLYRP1/PGN複合体がリガンドとして機能する際に、どのような形態のPGN がTREM-1を介してどのような細胞内シグナルを活性化して炎症増強をもたらすのか不明である。本研究においてPGLYRP1/PGNによるTREM-1を介 した炎症増強機構を明らかにし、細菌感染性敗血症や慢性炎症性疾患の病態をより正確に理解することを目的とする。
単球・マクロファージ系細胞におけるリガンドであるPGLYRP1/PGNのTREM-1シグナルに対する役割を解析するためには、TREM-1シグナルが伝達されていることを知る簡便な実験手法の確立が求められる。そこで、マウス単球・マクロファージ系J774.1細胞に、TREM-1シグナルの下流に位置するNFATの応答配列を有するルシフェラーゼレポーター遺伝子(NFAT-Luc)をstable transfection cellの構築を試みた。しかし、J774.1細胞はレポーター遺伝子を異物として認識し、細胞活性化、その結果細胞死が誘導された。そこで、DNAを異物認識から免れるNATE(invitrogen)を用いstable transfectantを得ようと試みている。PGLYRP1やPGNを購入申請しており、納品次第実験に着手する。
また、研究順序が異なるが最終年度に計画した細菌感染や炎症性腸疾患など疾患モデル動物の作成に着手した。これらについては、過去に報告されている症状が観察されている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
単球・マクロファージ系細胞におけるリガンドであるPGLYRP1/PGNのTREM-1シグナルに対する役割を解析するためには、TREM-1シグナルが伝達されていることを知る簡便な実験手法の確立が求められる。現在、NFATの応答配列を有するルシフェラーゼレポーター遺伝子(NFAT-Luc)をstable tlansfomationした細胞を取るのに時間が掛かっている。細胞がレポーター遺伝子を異物として認識し活性化してしまい、レポーター遺伝子を分解・排除、また細胞死を起こしてしまっているためだと考えられる。そこでDNAを異物認識から免れるNATE(invitrogen)を用いstable transfectantを得ようと試みている。また、TREM-1の下流のシグナルであるCa2+の変動を調べることでもPGLYRP1/PGNによるTREM-1活性化、TREM-1アゴニスト抗体による刺激との違いを調べることが可能であると思われる。現在、PGLYRP1/PGNを購入申請しており、レポーター遺伝子をstable tlansfomationした細胞が得られずとも、別のラインとして実験を構築し進めることも考えている。
計画研究の最終年度には疾患動物モデルを用いた実験が計画されている。研究室の諸事情により、動物実験を推し進めることが求められたため、細菌感染モデルやデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性炎症性腸疾患モデルの作成、乳酸菌投与による免疫賦活試験を試み、過去に報告されている症状や実験結果が観察されており、この点では研究を進めることが出来たと考える。
所属研究室の引越により研究環境を整えるのが予測よりも時間が掛かってしまっていることや、コロナ蔓延における大学構内への立ち入り規制など、研究時間が取れると思っていた時期に重なってしまったため、当初の予測よりもやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
単球・マクロファージ系細胞を用いたPGLYRP1/PGNとTREM-1アゴニスト抗体でのシグナル伝達の違いについて解析していく。レポーター遺伝子をStable transfectionした細胞の取得に時間が掛かっているが、細胞取得を継続すると同時に、レポーター遺伝子を使用せずCa2+の濃度上昇を指標としてTREM-1シグナル伝達を調べることも可能であると考えられる。Ca2+として蛍光Ca2+指示薬を、解析機器としてFACSアナライザーを使用し、PGLYRP1/PGNあるいはTREM-1アゴニスト抗体を固着させたプレートにJ774.1細胞を播種、刺激を入れその後のCa2+の様式を調べる。その際、ペプチドグリカンから生成されるPAMPsによる細胞内シグナル活性化を除外するために、TLR2中和抗体やNODs阻害剤を利用する。次に、TREM-1シグナルの下流で稼働するリン酸化酵素群MAPKs (ERK、p38、JNK) について、PGLYRP1/PGNあるいはTREM-1アゴニスト抗体でのシグナル伝達の違い(稼働するリン酸化酵素群の違い、シグナル伝達の開始時間や長さなど)について検討していく。
次に、PGLYRP1は分子内にZn2+結合ドメインが存在しZn2+やCa2+など二価陽イオンが殺菌活性に関与することが知られているため、ペプチドグリカンの種類や補因子など、TREM-1リガンド活性に影響を与える因子について検討を行っていく。ペプチドグリカンの分子サイズや由来とする菌種を変えることで、TREM-1の活性化に必要な分子群の同定や補因子の探索を行い、ペプチドグリカンのリガンド能について検討する。
細菌感染モデルやデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性炎症性腸疾患モデルの作成による動物実験については初年度でも結果が出てきているため、研究計画の前後はあるものの継続していく。
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| Causes of Carryover |
学内における研究室の引越やコロナの影響により、研究時間が取れず研究が進んでいない。
次年度繰り越しする金額で現在購入申請している様々な菌種由来のペプチドグリカンやPGLYRP1、Ca2+指示薬など前年度購入できなかったが研究遂行のために必要不可欠な消耗品の購入に充てる。
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Research Products
(1 results)
