Role of TREM-1 signaling by PGLYRP1/PGN in inflammatory diseases

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16654
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture
• Principal Investigator: 細田 浩司 東京農業大学, 生命科学部, 准教授 (40408662)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 炎症性疾患 / TREM-1 / ペプチドグリカン

Outline of Annual Research Achievements

TREM-1はマクロファージの膜受容体として、炎症性サイトカイン産生を増強し敗血症の病態を悪化させる。また、TREM-1は様々な非感染性の慢性炎症性疾患 の増強因子として働くことも明らかにされている。近年、好中球顆粒成分のペプチドグリカン(PGN)認識タンパクPGLYRP1が菌体の PGNとともにTREM-1リガンドとして働くことが報告されたが、PGLYRP1/PGN複合体がリガンドとして機能する際に、どのような形態のPGNがTREM-1を介してどのような細胞内シグナルを活性化して炎症増強をもたらすのか不明である。本研究においてPGLYRP1/PGNによるTREM-1を介 した炎症増強機構を明らかにし、細菌感染性敗血症や慢性炎症性疾患の病態をより正確に理解することを目的とする。
まず、マウス単球・マクロファージ系J774.1細胞に、TREM-1シグナルの下流に位置するNFATの応答配列を有するルシフェラーゼレポーター遺伝子(NFAT-nanoLuc)をstable transfectionさせた細胞株を作製した。この株化細胞樹立にはtransgeneを異物認識から免れさせるNATE試薬(invitrogen)を用いた。現在購入したPGLYRP1やPGNを用いて、J774.1細胞におけるTREM-1シグナル伝達に必要なPGNの形態や菌種による違いなどについて解析を行っている。 また、研究順序が異なるが最終年度に計画した細菌感染や炎症性腸疾患など疾患モデル動物の作成については、リステリアモノサイトゲネス感染マウスにおいて乳酸菌投与による免疫賦活能の亢進（IFNγレベルの亢進）が、DSS誘導性炎症性腸疾患マウスにおいて乳酸菌投与による症状の緩和効果（体重減少の緩和や大腸長の延長）が観察されており、先行して研究が進んでいる。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

単球・マクロファージ系細胞におけるリガンドであるPGLYRP1/PGNのTREM-1シグナルに対する役割を解析するためには、TREM-1シグナルが伝達されていることを知る簡便な実験手法の確立が求められる。まず、マウス単球・マクロファージ系J774.1細胞に、TREM-1シグナルの下流に位置するNFATの応答配列を有するルシフェラーゼレポーター遺伝子(NFAT-nanoLuc)をstable transfectionさせた細胞株を作製した。この株化細胞樹立にはtransgeneを異物認識から免れさせるNATE試薬(invitrogen)を用いた。現在購入したPGLYRP1やPGNを用いて、J774.1細胞におけるTREM-1シグナル伝達に必要なPGNの形態や菌種による違いなどについて解析を行っている。
また、 計画研究の最終年度には疾患動物モデルを用いた実験が計画されている。計画が前後してしまったが、細菌感染モデルとしてリステリアモノサイトゲネス感染マウスを作製し、乳酸菌投与による免疫賦活能の亢進（IFNγレベルの亢進）が観察されている。一方、炎症性疾患モデルとしてデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性炎症性腸疾患モデルを作成し、乳酸菌投与による症状の緩和効果（体重減少の緩和や大腸長の延長）が観察されている。これらのモデルに対してTREM-1のペプチドやペプチドグリカン認識タンパク質PGLYRP1投与の病態への影響についても解析していく予定である。
個々の研究内容については進んでいるものもあるが、全体としてはコロナ禍により所属機関への立ち入りが規制され、学生指導についてもオンライン講義や感染症対策などに多くの時間が取られてしまい当初の予測よりも遅れている。

Strategy for Future Research Activity

単球・マクロファージ系細胞を用いたPGLYRP1/PGNとTREM-1アゴニスト抗体でのシグナル伝達の違いについて解析していく。レポーター遺伝子をStable transfectionした細胞を取得しており、PGLYRP1/PGNあるいはTREM-1アゴニスト抗体を固着させたプレートにJ774.1細胞を播種、PMAなどのCa2+流入を促進する試薬をポジティブコントロールとし、マクロファージ系細胞におけるTREM-1活性化に必要なPGNの形態や菌種による違いなどについて解析を行っていく。その際、ペプチドグリカンから生成されるPAMPsによる細胞内シグナル活性化を除外するために、TLR2中和抗体やNODs阻害剤を利用する。
次に、TREM-1シグナルの下流で稼働するリン酸化酵素群MAPKs (ERK、p38、JNK) について、PGLYRP1/PGNあるいはTREM-1アゴニスト抗体でのシグナル伝達の違い(稼働するリン酸化酵素群の違い、シグナル伝達の開始時間や長さなど)について検討していく。 次に、PGLYRP1は分子内にZn2+結合ドメインが存在しZn2+やCa2+など二価陽イオンが殺菌活性に関与することが知られているため、ペプチドグリカンの種類や補因子など、TREM-1リガンド活性に影響を与える因子について検討を行っていく。ペプチドグリカンの分子サイズや由来とする菌種を変えることで、TREM-1の活性化に必要な分子群の同定や補因子の探索を行い、ペプチドグリカンのリガンド能について検討する。
細菌感染モデルやデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性炎症性腸疾患モデルの作成による動物実験については結果が出てきているため、研究計画の前後はあるものの継続していく。

Causes of Carryover

コロナ禍における研究室への立ち入り制限や、オンライン講義の準備、感染症対策などに時間をとられ、研究時間が取れず研究が進んでいない。 次年度繰り越しする金額で現在購入申請している様々な菌種由来のペプチドグリカンや阻害剤、前年度購入できなかったが研究遂行のために必 要不可欠な消耗品の購入に充てる。