2019 Fiscal Year Research-status Report
Comprehensive metagenomic analysis of intestinal bacterial and viral flora in Alzheimer's disease
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19K17028
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
植松 未帆 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 特任助教 (80815647)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | メタゲノム / 次世代シーケンサー / 腸内微生物叢 / パーキンソン病 / アルツハイマー病 / KEGG |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、腸内微生物叢が腸脳相関を介して神経変性疾患の病態に影響を与える可能性が示唆されている。一方、viral dark matterと呼ばれる腸内ウイルス叢のゲノム配列や機能、種々の疾患との関係については、ほとんど分かっていない。本研究の目標は、腸脳相関により腸内環境から強い影響を受けると考えられている神経変性疾患、なかでもアルツハイマー病やパーキンソン病などに着目し、これらの神経変性疾患患者の糞便サンプルにおける、細菌叢とウイルス叢のメタゲノムを健常コントロールのものと比較し、コントロール群と疾患群で異なる微生物叢の組成および遺伝子機能の有無を検討することである。本年度は、まず、パーキンソン病の患者の糞便サンプルについて、腸内細菌およびウイルスのゲノムを抽出後、次世代シーケンサーを用いてゲノム配列を解析した。さらに、スーパーコンピュータを用いた情報解析を行い、パーキンソン病患者の腸内微生物叢の構成の同定を行った。さらに、得られた微生物の配列から同定された遺伝子を機能データベース（KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）で相同検索することにより、代謝系やシグナル伝達系におけるパスウェイをはじめとするさまざまな遺伝子機能解析を行った。これらの網羅的解析により、腸内微生物叢と宿主の間で異なる微生物叢の構成および遺伝子群等に注目し、その意義を検討した。今後アルツハイマー病等、他の神経変性疾患の糞便サンプルについても同様に解析を進め、病態に関連する微生物叢の異常（dysbiosis)の有無について検討していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
パーキンソン病患者の糞便サンプルからの微生物叢の遺伝子抽出：パーキンソン病の患者の糞便サンプルを地域中核病院脳神経内科に受診中のさまざまな臨床的重症度の患者から募集して集め、個々の糞便サンプルから、微生物叢ごとに最適化された遠心分離処理、フィルター処理および溶菌酵素処理等により①細菌、②遊離ウイルス、③細菌への付着ウイルスの3種類に分けて、それぞれに遺伝子を抽出した。これらの遺伝子に、次世代シーケンサー用のカスタムアダプター配列をライゲーションしてライブラリを作成し、塩基配列を決定した。
メタゲノムデータ解析：次世代シーケンスによって得られたゲノムデータは、スーパーコンピュータを利用して解析を行った。申請者の研究室において産出された既存のメタゲノムデータと公共データベースそれぞれから得られるゲノム配列の情報をリファレンスデータとして用い、微生物種を推定し、パーキンソン病患者の腸内微生物叢の構成の同定を行った。得られたデータにつき、申請者の研究室の解析している既存の健常者のデータと比較し、疾患群に特徴的な微生物叢の異常（dysbiosis）について検討した。
遺伝子機能解析（KEGGパスウェイ解析）：スーパーコンピュータを利用して、KEGGパスウェイ解析のパイプラインを用いて遺伝子機能解析、パスウェイ解析を行った。上記によって得られたデータにつき、申請者の研究室の解析している健常者のデータと比較し、疾患群に特徴的なKEGGパスウェイについて検討した。
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| Strategy for Future Research Activity |
種々の神経変性疾患での検討：本年度はパーキンソン病に焦点を当てて解析を進めてきた。今後は、アルツハイマー病等、gut-brain axisにより腸内環境から強い影響を受けると考えられているパーキンソン病以外の種々の神経変性疾患についても同様の手法を用いて腸内微生物叢およびその遺伝子機能を解析し、相互に比較・検討する。
より詳細な遺伝子機能解析（KEGGパスウェイ解析）：スーパーコンピュータを利用し、KEGGパスウェイ解析のパイプラインを用いて遺伝子機能解析、パスウェイ解析を行い、特に、免疫系や炎症誘導や、タウ蛋白・アミロイドβ蛋白・αシヌクレイン蛋白等の疾患関連蛋白の代謝経路およびエピジェネティックな修飾に影響を与える可能性のある分子に注目して、疾患関連分子を探索する。
神経病理学的検討：疾患群に特徴的な微生物叢の異常（dysbiosis）および遺伝子機能（KEGGパスウェイ）の異常を同定することによって、新規の疾患関連分子の候補を挙げる。その分子について、免疫組織化学の手法によって剖検脳における分布を検討し、神経病理所見との関係性をマクロ（脳全体での分布の網羅的解析）とミクロ（多重免疫電顕等）の両視点から行う。
将来の研究のための準備：上記の解析で得られた知見から将来の動物実験などの実験系を検討し、マウス糞便移植実験等に備え、嫌気条件化での糞便サンプル冷凍保存を行う等、新たな治療法を見出す準備を行う。
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| Causes of Carryover |
次年度は、本年度よりも多数の症例について糞便サンプルのメタゲノム解析を行う予定である為、次年度に必要な解析費用の増大が見込まれ、次年度使用額が生じた。
使用計画：次世代シークエンス解析のために、ライブラリー作成用の試薬類やシークエンスキット、ディスポ製品、ガラス器具などを購入するための費用を増額する予定である。また、メタゲノムビッグデータ解析のために、スーパーコンピュータの使用は必要不可欠である。次年度は本年度より多数の症例の解析を行う予定のため、それに伴いデータ量が増大することが見込まれ、スーパーコンピュータの計算資源の利用費用とデータバックアップのためのハードディスク費用を増額する予定である。
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Research Products
(3 results)
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[Journal Article] Antigen-Specific Mucosal Immunity Regulates Development of Intestinal Bacteria-Mediated Diseases.2019
Author(s)
Fujimoto K, Kawaguchi Y, Shimohigoshi M, Gotoh Y, Nakano Y, Usui Y, Hayashi T, Kimura Y, Uematsu M, Yamamoto T, Akeda Y, Rhee JH, Yuki Y, Ishii KJ, Crowe SE, Ernst PB, Kiyono H, Uematsu S
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Journal Title
Gastroenterology
Volume: 157
Pages: 1530-1543
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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