粉末siRNA製剤を用いたCCL15を標的とする気管支喘息の新規経気道治療の開発

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K17637
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 宮本 真太郎 広島大学, 病院(医), 講師 (30633995)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 気管支喘息 / CCL15 / 喘息モデルマウス

Outline of Annual Research Achievements

誘発喀痰上清中のCCL15の濃度は、気管支喘息患者において健常者と比べ有意に高値であり、気管支喘息患者の誘発喀痰上清中のCCL15濃度と血清ペリオスチン濃度との間には有意な相関が認められた。これらより、気管支喘息患者の気道においてCCL15の発現が亢進しており、気道中のCCL15は気管支喘息の診断や病勢の把握に役立つバイオマーカーとして有望であり、またCCL15は特に気道炎症や気道リモデリングといった気管支喘息の主病態および難治化に関わっている可能性があることが示唆された。
続いて、喘息モデルマウスを用いた研究を行うこととしたが、CCL15はマウスには存在しないため、他のヒトCCL15に関する研究と同様に、ヒトCCL15のマウスにおけるオルソログ（相同遺伝子）であるCCL9を用いて、マウスにおける研究を行った。マウス気道におけるCCL9発現の程度を気管支肺胞洗浄液（BALF）中のCCL9濃度の測定により、また気道におけるCCL9発現部位の同定を肺組織のCCL9免疫染色を用いて、喘息モデルマウスとコントロールマウスとを比較することで検討した。すると、喘息モデルマウスではコントロールマウスと比較してBALF中のCCL9濃度は有意に上昇しており、また喘息モデルマウス肺組織におけるCCL9免疫染色の結果、気道上皮細胞，気道平滑筋細胞，血管内皮細胞，気道上皮下の炎症細胞にCCL9が発現していることを確認できた。以上より、喘息モデルマウスの気道においてCCL9が発現亢進していることが示され、マウスCCL9（ヒトCCL15）は喘息病態へ関与している可能性が高く、喘息治療標的として有望であると考えられた。今後は、喘息モデルマウスにおいてsiRNAを用いて気道のCCL9を経気道的にノックダウンする治療の開発を進め、最終的にはヒト気道のCCL15を標的とする新規喘息吸入治療の開発を目指す。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

誘発喀痰および野生型喘息モデルマウスを用いた検討により、ヒトCCL15（マウスCCL9）の喘息病態への関与については、ここまである程度は想定していた通りに示すことができた。その後、当初はCCL9ノックアウトマウスを用いた喘息モデルについて検討を行う方針であったが、信頼性の高いCCL9ノックアウトマウスを予算内で入手することが困難であった。しかし、ヒトCCL15（マウスCCL9）が喘息病態へ関与していることが示され、ヒトCCL15（マウスCCL9）は喘息治療標的として有用な可能性は十分あると考えられるため、野生型喘息モデルマウスにおいてCCL9を標的としたsiRNAの経気道投与による新規喘息治療の開発を進めることとした。

Strategy for Future Research Activity

（ヒト誘発喀痰を用いた研究）：誘発喀痰中のCCL15濃度と、各種サイトカイン，喘息患者の各種背景因子との関連について解析を進めていく。
（マウスを用いた研究）：ヒトCCL15（マウスCCL9）を標的としたsiRNAの経気道投与による喘息治療効果の検討：マウスCCL9を標的とした液体siRNA、さらにはマウスCCL9を標的としたキトサンベクター粉末siRNAを喘息モデルマウスに経気道投与することで、気道炎症，気道過敏性，気道リモデリングがどのように改善するかを調べる。具体的にはまず、既報より大腸癌細胞株CMT93が CCL9を高発現することが判明しており、CMT93を用いたin vitroの実験を行い、CCL9を標的とする液体siRNA（CCL9-siRNA）によるCCL9のノックダウン効果を調べる。そのin vitroの実験結果を元に、液体CCL9-siRNAの喘息モデルマウスへの経気道投与する際の濃度を設定する。続いて、その設定濃度の液体CCL9-siRNAを喘息モデルマウスに経気道投与を行い、BALF中のCCL9濃度や気道炎症，気道過敏性，気道リモデリング等に及ぼす影響を、液体コントロールsiRNAを経気道投与した喘息モデルマウスと比較検討する。そして、蛍光標識した液体CCL9-siRNAを喘息モデルマウスへ経気道投与し、その肺組織を蛍光顕微鏡で解析することにより、液体CCL9-siRNAの気道における効果発現部位の同定を行う。液体のCCL9-siRNAの経気道投与による喘息病態の改善効果が証明できれば、その後にはマウスCCL9（ヒトCCL15）を標的とするキトサンベクターを用いた粉末siRNA経気道治療の開発につなげる予定である。

Causes of Carryover

当初は、CCL9ノックアウトマウスを用いた喘息モデルについて検討を行う方針であったが、信頼性の高いCCL9ノックアウトマウスを予算内で入手することが困難であった。そこで、喘息モデルマウスのBALFの実験結果からは喘息モデルマウスの気道においてCCL9が発現亢進していることは確認できており、CCL9は喘息病態へ関与している可能性が高く、喘息治療標的として有望である可能性も高いと考えられたため、喘息モデルマウスにおいて気道のCCL9を経気道的にノックダウンする研究を進めることとした。今年度の研究費でsiRNA（CCL9を標的としたもの，コントロール，蛍光標識したもの等）購入，マウス購入，マウス用の各種サイトカインELISAキット購入，喘息モデルマウス作製用の抗原（卵白アルブミン）購入等の費用をまかなう予定である。