2019 Fiscal Year Research-status Report

Clinical indication of anti-PD-1/anti-PD-L1 antibody for breast cancer

Research Project

Project/Area Number	19K18062
Research Institution	Fukushima Medical University
Principal Investigator	中山裕子福島県立医科大学, 医学部, 博士研究員 (90769001)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	乳癌 / 腫瘍微小環境 / EMT / PD-L1 / 小葉癌
Outline of Annual Research Achievements	癌治療において、Immune Checkpoint Inhibitors (ICIs) が世界的に注目されている。特に抗PD-1/抗PD-L1抗体は、その中心的な役割を担い、乳癌領域でも手術不能・再発乳癌に対して抗PD-L1抗体（化学療法との併用）が適応となった。一方で、いまだバイオマーカーが確立していない事が、乳癌も含め各癌腫で問題となっている。我々は、先行研究において、IFN-γ signaling pathwayの一つであるphospho　signal transducer and activator of transcription 1 (p-STAT1)が、乳癌における抗PD-1/抗PD-L1抗体療法のバイオマーカーとなる可能性を報告した。この研究課程で、IFN-γ経路とは異なるPD-L1の発現機構を認め、この傾向は小葉癌に強かった。小葉癌の生物学的性質を考慮すると、上皮間葉転換 (epithelial-mesenchymal transition： EMT) が関与している可能性が高いと考えられる。本研究は、乳癌におけるEMTとPD-L1発現の関連性に焦点を置き解析を行う。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 2010年～2018年における山梨大学医学部附属病院の乳癌手術症例のデータベースを作成し、本研究内容について山梨大学医学部倫理委員会に申請した。2019年12月5日、本研究に対して同委員会委員長の承認を得た（受付番号:2151 研究課題名「乳癌における抗PD-1/抗PD-L1抗体の治療適応」）。臨床検体を用いてPD-L1・HLA-class I・p-STAT1・E-cadherin・vimentinの予備染色を行い、いずれも問題なく染色されることを確認した。現在、対象症例の手術切除標本を用いて連続切片を作成し、免疫染色を施行中である。また、本年度の実験に備え、必要物品を準備した。
Strategy for Future Research Activity	本年度は、対象症例の免疫染色を引き続き行い、PD-L1・HLA-class I・p-STAT1・E-cadherin・vimentinの発現を評価する。評価方法：E-cadherin・vimentin・PD-L1は癌細胞膜の染色強度をH-scoreを用いて半定量化する。HLA class Iは癌細胞膜の発現の有無で評価する。E-cadherin low score、vimentin high score typeをEMT phenotypeとする。EMT phenotypeとHLA class I, PD-L1の発現などの関係について統計学的に解析する。免疫染色評価と並行して、乳癌細胞株での検証を行う。対象：5種類のヒト乳癌細胞株； MCF7 (ER+HER2-)、BT474 (ER+HER2+)、SKBR3 (ER-HER2+)、MDA-MB-231 (TNBC)、MDA-MB-134-VI (浸潤性小葉癌) 研究方法：① GSK-3βを用いて乳癌細胞株をEMT化させる。上皮系マーカーはE-cadherin、間葉系マーカーはvimentin、Snail、ZEB-1とし、Western blottingでE-cadherin、vimentinの発現、PCRでE-cadherin、Snail、ZEB-1の発現を確認する。② EMT化した乳癌細胞株におけるPD-L1とHLA class Iの発現の変化をFlow cytometryとPCRで確認する。③ Blocking assay；IL-2でT細胞を刺激しPD-1を発現させる。EMT化した乳癌細胞株とIL-2で刺激したT細胞を共培養する。Control抗体、各抗体 (抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体) 存在下におけるT細胞の生存率と増殖能について解析する。研究結果が得られたら、随時学会で発表し、論文報告を行う。
Causes of Carryover	今年度は、乳癌症例に対し免疫組織染色を用いた更なる解析が必要となる。また、複数のヒト乳癌細胞株を用いた実験(EMT化前後におけるPD-L1発現の違い等)、CD8陽性T細胞を用いた実験(抗PD-1/抗PD-L1抗体を用い、Blocking assayを施行)を行う。そのため、抗体・試薬・細胞培養液・ディスポーザブル用品等、物品費が必要となる。