神経芽腫における脱分化脂肪細胞由来exosomeを用いた分化誘導療法の新規開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K18072
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 星 玲奈 日本大学, 医学部, 専修医 (20793772)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 神経芽腫 / 脱分化脂肪細胞 / exosome / 分化誘導療法

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、手術時に得られた脂肪組織から脱分化脂肪細胞(Dedifferentiated fat cells: DFAT)を調整・継代培養し、DFATの培養上清を回収して、Exoquick-TCを添加後に遠心することでDFAT exosomeの単離を可能とした。さらに、神経芽腫細胞に対するDFAT exosomeの抗腫瘍効果について確認するために、MYCN非増幅であるヒト神経芽腫細胞株のSK-N-SHにDFAT exosomeを添加して培養し、神経芽腫細胞の形態変化と分化の有無を検討した。DFAT exosomeを添加して培養したSK-N-SHは、DFAT exosomeを添加せずに培養した時と比べて、神経突起伸長が認められた。また、培養した細胞からRNAを抽出し、Real-time RT-PCR法で、神経分化マーカーとしてNeurofilament(NF)とβⅢtubulin(TUBβⅢ)の遺伝子発現解析を行った。その結果、コントロール群と比べて、DFAT exosome添加群でNFのmRNA発現上昇を認め、TUBβⅢのmRNA発現量も上昇を認めた。また、DFAT exosome添加量を2倍にすると、さらなる神経突起の伸長とNFやTUBβⅢのmRNA発現量の上昇を認めた。このことから、DFAT exosomeは神経芽腫細胞に対して分化誘導効果を持つ可能性が示唆され、その分化誘導効果はDFAT exosome濃度依存的に増強する可能性が示唆された。今後は、DFAT exosomeが神経芽腫細胞に対して増殖抑制効果を認めるか検討する必要があり、また、悪性度の高いMYCN遺伝子が増幅している神経芽腫細胞株でも同様に分化誘導効果が得られるか、および増殖抑制効果を認めるか検討を進めていく。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初、DFAT exosomeを添加して神経芽腫細胞を培養する際に、添加後7日間に神経芽腫細胞の分化能を評価する予定であったが、7日間だと神経芽腫細胞が増殖しすぎてしまい、細胞形態の確認が困難であったため、評価に最適な培養日数と細胞数などの条件を再検討するのに時間を要した。これにより、当初年度内を予定していたMYCN増幅株における同様の評価が現在進行中であるため、進捗はやや遅れていると判断した。

Strategy for Future Research Activity

ヒト神経芽腫細胞株のうち、MYCN増幅株にDFAT exosomeを添加して分化誘導効果が得られるかを、細胞形態の変化の確認と神経分化マーカーの遺伝子発現で確認をしていく。また、MYCN非増幅株でもMYCN増幅株でもDFAT exosome添加によって、神経芽腫細胞の増殖抑制効果が得られるかをWST-1 assayを用いて評価を行う。
MYCN増幅株でも分化誘導効果や増殖抑制効果が得られることが確認されたら、神経分化誘導に関わると報告されているmiR-133bがヒトDFATにも発現されているかReal-timeRT-PCR法で確認していく。さらに、マイクロアレイ法を用いてmiR-133b以外の神経分化誘導に関わるmiRNAを、網羅的に解析していく。神経分化に関わるmiRNAが確認された後、siRNAを用いて遺伝子発現を抑制したヒトDFAT株を作製し、そのヒトDFAT株からexosomeを単離して、ヒト神経芽腫細胞の分化が低下することを確認する。