2019 Fiscal Year Research-status Report
骨・軟骨特異的に発現する線維性コラーゲンの発現調節機構の解明と組織再生への応用
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19K18469
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
樋田 真理子 大分大学, 医学部, 客員研究員 (10737224)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | コラーゲン / 転写 / 骨 / 軟骨 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
線維性コラーゲン分子は、骨・軟骨細胞に特異的に発現しており、組織の機械的強度や柔軟性を提供するだけでなく、組織の発生、細胞の分化過程及び機能維持を厳密に制御している。それ故、適切な細胞外環境の異常や破壊が、骨・軟骨形成異常症などを引き起こす要因となる。そこで、線維性コラーゲン分子の骨・軟骨形成における役割について、転写や翻訳といった発現調節機構を検討するとともに、分化や機能維持に必要となる分子メカニズムを解明することを目的として解析を進めている。
遺伝子発現は、基本転写調節機構であるプロモーターと組織特異的転写調節機構であるシスエレメントの相互作用によって制御されており、プロモーターに関しては、XI型コラーゲン遺伝子では、転写因子NF-Yが、基本プロモーター領域においてプロモーター活性を制御していることが確認された。加えて、GC-rich領域がプロモーター活性に重要であり、転写因子Sp1によって発現が調節されていることも明らかとなった。また、XXVII型コラーゲン遺伝子においては、２つの選択的プロモーター領域を有していることが判明したが、未だ関与する転写因子の同定には至っていない。一方、シスエレメントに関しては、XI型及びXXVII型コラーゲン遺伝子それぞれの軟骨特異的エンハンサーが見出されたことから、軟骨特異的エンハンサーの生体内での機能を解明することに焦点をあて、関与する転写因子の検索を行うとともに、培養細胞やトランスジェニックマウスを用い組織内での発現パターンを検討し、その作用機序を明らかにする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
XI型及びXXVII型コラーゲン遺伝子各々の軟骨特異的エンハンサーの生体内での機能を明らかにするため、現在までに以下の解析を進めている。XI型コラーゲン遺伝子に関しては、軟骨特異的エンハンサー領域において、欠失ルシフェラーゼコンストラクトを作製し、領域の絞り込みを行っている。その配列により関与が示唆された転写因子に変異を加えたプローブに対し特異抗体を用い、エンハンサー活性に関与する転写因子の特定をEMSAにより検証している。さらに関与が示唆された転写因子のin vivo での結合をChip Assayにより確認を試みている。並行して、XI型コラーゲン遺伝子のエンハンサー近傍にあるサイレンサー部位に関与する抑制因子については、バイオインフォマティクス及び転写因子スクリーニング等により同定を試みている。また、トランスジェニックマウスに導入する軟骨エンハンサーをつないだβ-gal及びGFPのコンストラクト作製に時間を要しており、トランスジェニックマウスでの発現パターンの検討へは到達しておらず、遅延している。
一方、XXVII型コラーゲン遺伝子に関しては、2つの選択的プロモーターの内、軟骨組織への関与が示唆される基本プロモーター領域について、引き続き、領域を絞り込むため、長さの異なるルシフェラーゼコンストラクトを組み合わせ、ルシフェラーゼアッセイを行っているが、安定した結果が得られていない。また、関与が示唆される転写因子を同定するため、データーベースを用い検討を行っているが、特定には至っていない。軟骨特異的エンハンサー領域においては、関与する調節因子について、プロモーターとイントロンをつないだルシフェラーゼコンストラクトを作製し、ルシフェラーゼアッセイを行っており、領域を絞り込むとともに制御する転写因子の精査をする必要がある。以上のことから、進捗状況はやや遅れていると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
XI型コラーゲン遺伝子については、サイレンサー（抑制）因子をバイオインフォマティクス及び転写因子スクリーニング等により速やかに明らかにするとともに、トランスジェニックマウスへと導入する軟骨エンハンサーをつないだβ-gal及びGFPのコンストラクト作製を遂行し、トランスジェニックマウスによって発現パターンの検討を行う予定である。
一方、XXVII型コラーゲン遺伝子については、軟骨組織への関与が示唆される基本プロモーター領域について、ルシフェラーゼアッセイを行っているが、安定した結果が得られていないため、細胞への導入条件や導入方法を追求する必要があると考えている。
また、軟骨特異的エンハンサー領域においても、引き続きルシフェラーゼアッセイを行い、領域を絞り込むとともに制御する転写因子の精査を行い、機能解析を目指す予定である。
さらに、線維性コラーゲンにおいて、V型及びXXIV型コラーゲン遺伝子といった骨特異的転写調節機構についての生体内での解析や、骨芽細胞における網羅的スクリーニング法を行い、骨特異的シスエレメント領域の同定及び関与する調節因子をEMSAやChip Assay等によって検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
XI型及びXXVII型コラーゲン遺伝子において見出された軟骨特異的エンハンサー領域及び関与する調節因子の同定を試みているが、断定には至らず、現在進行中である。同様に、生体内での機能を明らかにするために、軟骨エンハンサーをつないだコンストラクト作製にも時間を要しており、遺伝子導入及びトランスジェニックマウス作製まで至っておらず、機能解析実験が計画通りに進行していない。したがって、細胞実験及び動物実験に関わる費用、付随する試薬・器具及び機器の購入費用として次年度に使用するため、初年度予算を繰り越すこととした。
今後は、各コラーゲン分子の転写や翻訳といった発現調節機構を明らかにするとともに、骨・軟骨細胞への分化過程に及ぼす影響や機能維持のための分子メカニズムの解明を進め、再生医療や骨格形成異常疾患等の診断・治療への応用を目指し、研究を発展させたい。
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